Flux de travail de la tomographie cryo-électronique pour tissus épais démontré dans l’hippocampe de souris

Mes recherches portent sur l’établissement d’un flux de travail standardisé pour la cryo-ET afin de permettre une analyse structurelle in situ de tissus épais comme l’hippocampe de souris. Les méthodes existantes manquent de fiabilité pour les tissus épais, ce protocole intègre donc des étapes optimisées pour une analyse standardisée. Pour commencer, placez une gouttelette de 10 L de solution de saccharose à 10 % sur une surface de verre propre.

Disséquez rapidement l’hippocampe d’une souris fraîchement euthanasiée. À l’aide d’une lame de rasoir bien aiguisée, retirez de petits morceaux de tissu de 0,5 à 1 millimètre cube. À l’aide d’un cure-dent ou d’une brosse fine, transférez le tissu sur les grilles TEM de support en cuivre préparées à l’intérieur du support de congélation à haute pression.

Utilisez du 2-méthylpentane pour maintenir le tissu humide et ajuster sa position sur la grille, tout en minimisant les contraintes mécaniques pour éviter les dommages à la grille. Ensuite, couvrez le tissu et la grille avec un disque en aluminium de cuivre de 3 millimètres de diamètre. Pour compléter l’assemblage, placez le second porte-frein de congélation haute pression, côté plat vers le bas, sur le dessus pour former un sandwich gaufré scellé.

Et vérifiez les paramètres de gel pour vous assurer qu’il n’y a pas d’anomalie dans l’instrument. Assurez-vous que le temps total entre la dissection des tissus et la congélation ne dépasse pas 90 secondes. Obtenir une nouvelle grille dorée de 300 mailles pour servir de grille de réception finale pour la procédure de démontage.

Sous un microscope stéréoscopique à température ambiante, clipsez doucement la grille dans un anneau AutoGrid CRYO-FIB compatible. Ensuite, stockez l’AutoGrid assemblé directement dans un four à sec, maintenu à environ 40 degrés Celsius, pour minimiser l’accumulation de givre avant utilisation. Tout en immergeant continuellement l’ensemble dans de l’azote liquide, séparez soigneusement la grille TEM vitrifiée des composants environnants de l’ensemble gaufre.

À l’aide de pinces à pointe fine pré-refroidies, séparez doucement les deux porte-avions de congélation à haute pression. Ensuite, sur une station de travail pré-refroidie à chargement cryogénique, montez la grille tissulaire isolée dans un second anneau CRYO-FIB AutoGrid sous la protection de l’azote liquide. Chargez les deux AutoGrilles dans les emplacements désignés du porte-échantillons de la navette cryo-transférée.

Orientez chaque AutoGrid de façon à ce que l’encoche de fraisage soit orientée vers l’extérieur et soit positionnée verticalement pour permettre un angle de fraisage plus bas. Gardez la navette entièrement chargée immergée dans de l’azote liquide ou maintenue en état pré-refroidi jusqu’à son transfert dans le FIB-SEM. Chargez l’étage d’échantillonnage dans l’instrument à l’aide de la tige d’échantillonnage.

Après un transfert cryogénique au microscope, naviguez vers la grille tissulaire à faible grossissement SEM. Ensuite, appliquer un revêtement de platine à 30 milliampères sur la surface de la grille pendant 15 secondes pour assurer une protection conductrice. Déposez un bouchon organométallique en platine d’une épaisseur de 0,5 à 1,0 micromètre en utilisant le système d’injection de gaz pendant environ 60 secondes.

Appliquez une couche finale de platine recouverte de sputter sur la surface de la grille à 30 milliampères pendant 15 secondes. À l’aide de l’image du faisceau d’électrons SEM, naviguez vers la région d’intérêt sélectionnée sur la grille tissulaire. Pour orienter l’échantillon pour le fraisage front-side, ajustez l’étage à environ 110 degrés de rotation et 7 degrés d’inclinaison afin de présenter la surface de l’échantillon à un angle favorable à l’accès au faisceau d’ions.

Pour le fraisage de tranchée, on définit une tranchée rectangulaire entourant le bloc tissulaire cible en utilisant le faisceau ionique fonctionnant à 30 kilovolts. Commencez à fraiser à distance du bloc en utilisant un courant relativement élevé de 15 nanoampères pour obtenir un retrait rapide du matériau. Lorsque les parois de tranchée s’approchent du bloc à quelques micromètres près, on réduit le courant du faisceau ionique à 7 nanoampères pour obtenir un contrôle du fraisage plus précis.

Laissez un côté du bloc attaché au matériau en vrac pour créer une languette de maintien temporaire. Pour les blocs de tissu d’une épaisseur estimée supérieure à 20 micromètres, effectuer une étape de fraisage sous-découpé depuis le côté inverse afin de faciliter le levage final. Faites pivoter la scène et ajustez l’inclinaison pour accéder au bas du bloc.

Fraisez la connexion inférieure en utilisant le faisceau d’ions concentré à 30 kilovolts et un courant de 3 nanoampères. Fraisez le dessous du bloc métallique pour qu’il s’ajuste fermement contre le bloc d’échantillon. Fraisez avec précision la surface de contact entre l’échantillon et le bloc d’or pour rendre le contact plus serré.

Pour fixer l’échantillon à l’aiguille, assurez-vous que le bloc d’or est en contact direct avec l’échantillon cible. En utilisant le faisceau d’ions focalisé à 30 kilovolts et 0,5 nanoampère, effectuez 8 à 12 motifs de fraisage séquentiels en section transversale à l’interface pour souder le bloc d’or à l’échantillon. Pour soulever le bloc tissulaire, sectionner la languette restante reliant le bloc à l’échantillon global à l’aide du faisceau d’ions focalisé.

Manœuvrez soigneusement l’aiguille du micromanipulateur pour soulever complètement le bloc tissu isolé hors de la tranchée et de la grille environnante. Rétractez l’aiguille et transportez le bloc vers la grille du récepteur. Faites naviguer l’aiguille du micromanipulateur vers une grille de récepteur en or pré-refroidie de 300 mailles.

Descendez le bloc sur une case de grille choisie. Meuler les petits cristaux de glace sur la grille pour que le bloc et la grille de tissu adhèrent plus fortement. Abaissez le bloc tissulaire pour qu’il touche juste la grille.

Moulez une tranche de 3 à 4 micromètres d’épaisseur du bloc sur le film grillé en utilisant le faisceau d’ions. Ensuite, soudez la tranche solidement par fraisage, en utilisant des motifs de section nettoyante des deux côtés de la jonction, puis réappliquez le revêtement conducteur et protecteur sur la surface de la grille comme démontré précédemment. Pour l’amincissement des lamelles, après avoir réglé l’inclinaison de la scène, définissez la position finale des lamelles dans une zone lisse du bloc tissulaire.

Effectuez un fraisage systématique en utilisant les courants de faisceau ionique et les compensations de sur-inclinaison spécifiés dans le tableau présenté. Lorsqu’il est à moins de 1 à 2 micromètres de la lamelle, il est possible de fraiser une tranchée de décharge de contrainte à environ 1,5 micromètre pour éviter que la lamelle ne se plie ou ne se plie. Après la préparation des lamelles, acquérez des images à l’aide de cryomicroscopie électronique.

Les blocs tissulaires traités par congélation à haute pression avec la méthode gaufre présentaient une apparence uniforme et transparente aux électrons. Les tomographies reconstruites ont résolu les structures mitochondriales dans l’environnement cellulaire. Les complexes macromoléculaires, tels que les ribosomes, étaient clairement résolus dans le cytoplasme.

Des caractéristiques cellulaires du cytosquelette et des membranes associées ainsi que des complexes poreux nucléaires étaient également visibles dans les tomographies reconstruites. Des structures et caractéristiques synaptiques, y compris les réserves de calcium et les structures de la gaine myéline, étaient clairement visibles dans les tomographies. Ce protocole permet aux chercheurs d’étudier directement la structure externe cellulaire native dans des environnements tissulaires complexes.

Le défi le plus critique de ce protocole cryo-ET est d’obtenir une vitrification uniforme et sans artefacts des échantillons de tissu épais. En suivant cette procédure, les chercheurs peuvent localiser les régions d’intérêt à l’aide de techniques de microscopie lumineuse et électronique corrélative ou de marquage, puis effectuer une moyenne sous-tomographique et une analyse de structure pour résoudre les complexes macromoléculaires.