Séquençage et assemblage de plasmides à longue lecture utilisant des flux de travail basés sur le séquençage nanopore

Nous étudions la réplication, le maintien et la diffusion d’éléments circulaires d’ADN auto-réplicatifs, appelés plasmides, ce qui nécessite la détermination de leurs séquences. Ce protocole traite les problèmes de couverture et de précision liés au séquençage à longue lecture en enrichissant l’ADN plasmidique et en optimisant les méthodes d’assemblage. Notre protocole est conçu pour séquencer les plasmides dans des situations où la séquence chromosomique est connue ou sans importance.

Pour commencer, rayez les échantillons sur des plaques de tarière LB complétées par l’antibiotique approprié pour sélectionner le marqueur de résistance transmis par plasmide respectif. Incubez les plaques à 37 degrés Celsius pendant 24 heures. Le lendemain, inoculez trois à cinq millilitres de médium LB complété avec l’antibiotique approprié avec une seule colonie isolée.

Incubez la culture en secouant à 37 degrés Celsius pendant environ huit heures ou jusqu’à ce que la densité optique à 600 nanomètres atteigne un à deux. Ensuite, inoculez 400 millilitres de milieu LB complétés avec l’antibiotique approprié avec 400 microlitres de culture de démarrage, puis incubez comme démontré précédemment. Ensuite, transférez la culture dans des bouteilles centrifugeuses adaptées au volume de culture.

Centrifugez à 4 200 G pendant 10 minutes et resuspendez la pellete en utilisant les volumes de réactifs recommandés par le fabricant. Après la lyse et la neutralisation cellulaires, centrifugez le lysat à 4 200 G pendant 30 minutes. Transférez le surnageant dans un nouveau tube et centrifugez-le à nouveau.

Effectuez l’équilibrage, le lavage et l’élution de l’ADN selon les instructions du fabricant. Ensuite, resuspendez l’ADN précipité dans 100 microlitres d’eau sans nucléase pour maximiser la concentration en vue de la préparation de la bibliothèque de nanopores. Ensuite, pour quantifier l’ADN, préparez les tubes de test selon le tableau présenté.

Après avoir calibré le fluoromètre, insérez les tubes d’échantillonnage dans le fluoromètre et notez les relevés selon le manuel de l’instrument. Programmez le thermocycleur à 30 degrés Celsius pendant deux minutes, suivi de 80 degrés Celsius pendant deux minutes. Faites tourner et mélanger les composants décongelés du kit selon le tableau présenté.

Incubez les tubes PCR préparés pour le codage à barres à l’aide du programme thermocycleur. Ensuite, placez les tubes sur de la glace pour les refroidir. Regroupez les échantillons codés à barres dans un tube Eppendorf propre de 1,5 millilitre, en veillant à ce que le volume total ne dépasse pas 1 000 microlitres.

Une fois les billes en vortex, ajoutez un volume égal de billes aux échantillons codés à barres regroupés. Mélangez en faisant un coup sec sur le tube, suivi d’une incubation de 10 minutes. Ensuite, lavez les billes avec un millilitre d’éthanol à 80 % pendant que vous êtes sur l’aimant.

Retirez l’éthanol et répétez une fois. Retirez le tube de l’aimant. Suspendez les billes dans un tampon d’élution en utilisant le volume approprié basé sur le nombre de codes-barres utilisés et faites couver pendant 10 minutes à température ambiante.

Quantifiez la concentration d’ADN à l’aide d’un microlitre de l’échantillon éludé sur le fluoromètre pour confirmer la préparation réussie de la bibliothèque. Pour la ligation de l’adaptateur, transférez 11 microlitres de la bibliothèque d’ADN dans un nouveau tube et marquez-le. Ensuite, mélangez les composants présentés dans un tube neuf pour diluer l’adaptateur rapide décongelé.

Ensuite, ajoutez un microlitre d’adaptateur rapide dilué à la bibliothèque de 11 microlitres d’ADN et faites tourner le tube pour mélanger le contenu. Faites tourner brièvement le tube pour vous assurer que le volume complet se ramasse au fond et faites couver le tube sur le banc pendant cinq minutes. Préparez le mélange d’amorçage des cellules de flux dans un tube d’ADN frais et mélangez par inversion et pipetage.

Soulevez le couvercle de l’appareil et insérez la cellule de flux à l’intérieur tout en appliquant une pression douce pour garantir un bon positionnement. Après avoir vérifié la présence de bulles d’air à l’intérieur ou à proximité du port d’amorçage, retirez 20 à 30 microlitres de liquide pour éliminer les bulles. Ensuite, préparez 800 microlitres de mélange d’amorçage et injectez-le dans le port d’amorçage en évitant les bulles d’air, puis laissez reposer l’appareil cinq minutes.

Mélangez la bibliothèque d’ADN avec le volume approprié de billes bibliothèque dans un nouveau tube présenté ici. Chargez 200 microlitres de mélange d’amorçage dans le port d’amorçage de la cellule de flux. Ajustez le couvercle du port de l’échantillon pour révéler le port.

Distribuez 75 microlitres de la bibliothèque d’ADN avec des billes dans le port d’échantillon, une goutte à la fois, en laissant chaque goutte absorber avant d’ajouter la suivante. Ensuite, remettez le couvercle du port d’échantillon et refermez le port d’amorçage. Une fois le couvercle de l’appareil fermé, commencez la séquençage.

Fixez la limite de temps d’exécution en fonction du nombre de plasmides multiplexés, avec un défaut de 48 heures et un maximum de 72 heures. Sélectionnez le mode d’appel de base super précis et l’option de kit de codes-barres rapide appropriée. Ensuite, sélectionnez les données brutes FAST5 ou POD5 et commencez à appeler la base.

Pour générer un fichier FASTQ filtré pour l’assemblage en aval, coupez les lectures longues avec Filtlong afin de supprimer environ 5 à 10 % des lectures de moindre qualité tout en conservant environ 90 % du rendement total. Le sous-échantillon se lit avec Autocycler selon les réglages recommandés. Assemblez chaque sous-ensemble de lecture en utilisant Raven, Flye, Kanu, Miniasm, Myloasm, NECAT, Plassembler et d’autres assembleurs sélectionnés.

Visualisez chaque fichier graphique d’assemblage à l’aide d’un bandage. Évaluer les contigs pour la circularité, la consistance de taille entre assembleurs, et les preuves de joints chimériques. Supprimez les contigs linéaires manquant de support entre plusieurs assembleurs et conservez les contigs circulaires avec des estimations de taille cohérentes.

Retirer les contigs mineurs non soutenus avant la génération de consensus lorsque les plasmides majeurs sont circularisés. Procédez à la génération de consensus après la conservation manuelle. Générez la séquence de consensus à l’aide d’Autocycler avec les assemblages sélectionnés.

Exécutez les commandes Autocycler restantes pour produire la séquence finale de plasmides consensuels. Enfin, polissez l’assemblage final avec des lectures longues découpées avec Medaka pour améliorer la précision du consensus. Tous les tests de conjugaison produisaient des transconjugants, confirmant la présence d’un plasmide conjugatif chez les donneurs.

La taille des séquences plasmidiques assemblées correspondait aux estimations basées sur la mobilité de l’électrophorèse par gel de champ d’impulsion. Le séquençage nanopore a produit une qualité de lecture suffisante pour tous les échantillons analysés. Les taux de contamination chromosomique variaient entre 72,1 % et 28,0 % avec une moyenne de 46,9 %. L’analyse par électrophorèse en gel de champ pulsé du plasmide de souche UPEC_271 révélé une bande correspondant à un plasmide d’environ 145 paires de kilobases.

L’ADN de l’un des transconjugants a montré une séquence identique aux 145 kilobases. L’analyse par électrophorèse par gel de champ pulsuel du sang de souche 100913 identifié deux plasmides d’environ 70 et 110 paires de kilobases. Le séquençage nanopore a confirmé deux assemblages plasmidiques de 71 182 paires de bases et 111 226 paires de bases.

La considération la plus importante est de savoir si la séquence chromosomique est d’intérêt. Si c’est le cas, les protocoles standards de séquençage du génome entier sont meilleurs. La couverture accrue de notre protocole ouvre la porte à l’étude de l’hétéroplasmie, c’est-à-dire

variation de la séquence plasmidique au sein d’une population donnée.