Lactylation lysine spécifique à un site via expansion du code génétique chez E. coli et les cellules de mammifères

Nous avons développé un système d’horloge/ARNt RS pour surmonter le mimétisme et les limites enzymatiques, permettant une incorporation précise de la lactylation de la lysine pour étudier son système biologique. Ce protocole peut être appliqué à l’étude du métabolisme tumoral, des fonctions enzymatiques et des sites d’horloge. Pour commencer, co-transformer 50 microlitres de cellules chimiquement compétentes d’Escherichia coli DH10B avec environ 100 nanogrammes chacun des plasmides souhaités. Incubez le mélange de transformation sur de la glace pendant 25 minutes, puis faites un choc thermique à 42 degrés Celsius pendant 45 secondes.

Remettez le tube dans la glace pendant trois minutes. Ajoutez 350 microlitres de medium Luria bertani et secouez vigoureusement le tube à 220 tours par minute pendant une heure à 37 degrés Celsius. Maintenant, la culture cellulaire transformée est diffusée sur une plaque d’agar Luria bertani complétée par de l’ampicilline et du chloramphénicol.

Incubez la plaque à 37 degrés Celsius pendant 12 à 16 heures. Ensuite, prélève une seule colonie de la plaque pour inoculer une culture de démarrage de quatre millilitres et l’incube toute la nuit. Le lendemain, étendez la culture nocturne à 400 millilitres de milieu Luria bertani contenant de l’ampicilline et du chloramphénicol.

Secouez vigoureusement la culture à 220 tours par minute et à 37 degrés Celsius jusqu’à ce que la densité optique à 600 nanomètres atteigne entre 0,6 et 0,8. Ensuite, induire la culture avec 0,2 % de L-arabinose et une millimolaire lactyllysine et incuber à 30 degrés Celsius et 220 tours par minute pendant 16 heures. Les cellules de semence sont sur une plaque de 12 puits à une densité de 1 fois 10 à la puissance de cinq cellules par puits, utilisant un millilitre de DMEM.

Incubez pendant 24 heures jusqu’à ce que la confluence cellulaire atteigne entre 70 et 80 %, puis procédez à la transfection. Pour préparer la solution d’ADN diluée, ajoutez 0,75 microgramme de plasmide contenant un rapporteur sfGFP et des pNeu-KlacRS dans un rapport un-un dans 38 microlitres de DMEM sans sérum avec un taux élevé de glucose. Pipeter doucement de haut en bas ou faire un vortex brièvement pour mélanger.

Pour préparer le réactif de transfection dilué, ajoutez 2,25 microlitres de réactif à 38 microlitres de DMEM sans sérum avec un taux élevé de glucose. Pipetez doucement trois à quatre fois pour bien mélanger. Ajoutez immédiatement le réactif de transfection dilué à la solution d’ADN dilué d’un coup.

Maintenant, pipettez trois à quatre fois pour mélanger le contenu et incubez la solution à température ambiante pendant 10 à 15 minutes pour permettre à la transfection et aux complexes d’ADN de se former. Ajoutez 50 microlitres du complexe de transfection et d’ADN goutte par goutte sur le milieu de chaque puits et faites doucement tourner la plaque pour homogénéiser le mélange. Six heures après la transfection, remplacer le milieu par du DMEM frais contenant une millimolaire lactyllysine et cultiver les cellules pendant 24 à 48 heures.

Chez Escherichia coli, une hENO1-89Klac pleine longueur a été produite lorsqu’une millimolaire lactyllysine a été ajoutée au milieu de croissance. L’immunoblotting a confirmé la présence de hENO1-89Klac de pleine longueur utilisant anticorps anti-Hi-tag et anti-L-lactyl lysine. La spectrométrie de masse du temps d’ionisation par électropulvérisation a révélé un pic dominant à 48 178 Daltons, correspondant à la masse attendue de hENO1-89 Klac sans la méthionine initiatrice.

La spectrométrie de masse en tandem du triptyque a digéré confirmé l’incorporation spécifique au site de Klac au résidu 89 grâce à la présence d’une série complète d’ions B&Y cartographiant le peptide modifié. Chez les cellules HEK293T mammifères, la microscopie à fluorescence a montré une forte expression de sfGFP dans toutes les cellules lorsque Klac a été ajouté pendant 24 heures et 48 heures, tandis qu’aucune fluorescence n’a été observée sans supplémentation en Klac. La cytométrie en flux a révélé qu’environ 31 % des cellules exprimaient la sfGFP après 24 heures, augmentant à environ 37 % après 48 heures de supplémentation en Klac.

Ce protocole permet d’étudier les effets spécifiques à la lactylation de la lysine sur la fonction des protéines et facilite la mesure des résultats biologiques et fonctionnels résultants. À la suite de cette procédure, les chercheurs peuvent réaliser des études mécanistiques, réaliser des tests de dépistage à haut débit et générer des lignées cellulaires stables pour une analyse fonctionnelle étendue. Nos études futures visent à améliorer l’efficacité, à permettre une intégration stable et à développer la biosynthèse des horloges.