Modèle de rat canulé par canal lymphatique cervical pour évaluer le transport lymphatique depuis la tête et le cerveau

Notre projet examine comment les lymphatiques cérébrales sont liées aux maladies du SNC, telles que la maladie d’Alzheimer, les AVC et les neuroinflammations, en identifiant les substances qui se drainent du cerveau. Les méthodes existantes manquaient d’un protocole et d’une approche fiable pour échantillonner et quantifier théoriquement l’écoulement lymphatique dérivé du SNC, ce qui est rendu possible par ce protocole. Pour commencer, préchargez environ 0,7 millilitre de solution anticoagulante diluée dans une seringue d’insuline stérile d’un millilitre à l’aide d’une aiguille de calibre 30 pour recouvrir la surface interne de la canule en polyéthylène.

Conservez la seringue préchargée dans des conditions stériles jusqu’à utilisation. Pour préparer les canules, utilisez des tubes de 0,5 millimètre de diamètre extérieur et 0,3 millimètre de diamètre intérieur pour les deux sections terminales, ainsi que des tubes de 0,6 millimètre de diamètre extérieur et intérieur de 0,5 millimètre pour la section centrale. À l’aide de ciseaux, coupez les segments de la canule à deux centimètres pour la partie proximale reliée à l’aiguille de la seringue, 40 centimètres pour la partie médiane, et huit centimètres pour la partie distale destinée à la canule.

Assemblez la canule en configuration tête à queue. Ensuite, coupez et biseautez l’extrémité distale de l’ensemble de la canule à un angle d’environ 45 degrés pour faciliter une insertion fluide dans le canal lymphatique cervical. Vérifiez la perméabilité de chaque canule en reliant la seringue préchargée à l’extrémité proximale de la canule assemblée.

Libérez doucement un petit volume de solution pour rincer la canule. Assurez-vous que la solution sorte en douceur par l’extrémité distale sans signe de fuite. Placez un rat anesthésié allongé sur un coussin chirurgical chauffé maintenu à 37 degrés Celsius.

Inclinez la tête et allongez le cou à l’aide d’un petit coussin de soutien, si nécessaire, pour augmenter l’exposition de la région cervicale. Maintenez doucement les membres antérieurs à l’aide d’élastiques ou de rubans chirurgicaux pour minimiser les mouvements. Rincez la fourrure de la région cervicale avec une solution stérile normale pour faciliter le rasage.

Ensuite, rasez soigneusement tout le site chirurgical pour garantir l’élimination complète des poils avant l’incision. Marquez le site de l’opération en traçant une ligne pointillée de 2,5 centimètres pour confirmer la longueur de l’incision initiale. Placez l’extrémité supérieure de l’incision environ un à 1,5 centimètre sous la lèvre inférieure.

Après avoir confirmé la profondeur anesthésique par le réflexe de pincement de l’orteil, incisez soigneusement la couche superficielle de la musculature cervicale le long de la ligne marquée. Ensuite, séparez doucement les couches musculaires restantes, principalement le fascia cervical superficiel, afin d’exposer l’artère cervicale. Rétractez le muscle sternomastoïdien et la glande sous-mandibulaire, puis inclinez-les loin du champ chirurgical pour faciliter l’identification du canal lymphatique cervical.

Utilisez un expanseur tissulaire pour maintenir la fenêtre chirurgicale. Avec un coton-tige, maintenez temporairement le tissu musculaire à l’écart tout en localisant le ganglion lymphatique et le canal lymphatique associé. Localiser le canal lymphatique opaque et incolore du col de l’utéral qui s’étend parallèlement à l’artère carotide.

À l’aide de pinces contondantes, faites passer doucement à travers les tissus conjonctifs séparés et maintenez les pinces en position. Isolez soigneusement le canal lymphatique cervical des tissus conjonctifs et adipeux environnants par dissection contondante. Ensuite, créez une petite incision dans la moitié supérieure du vaisseau exposé.

Une petite ponction secondaire cutanée à environ 1,5 centimètre de la fenêtre chirurgicale peut être créée pour servir de point de fixation supplémentaire à la canule. Insérez la canule par la seconde ouverture, saisissez son extrémité distale avec des pinces, et assurez-vous que sa face biseautée est orientée vers le haut. Ensuite, insérez doucement l’extrémité distale d’environ deux millimètres dans le canal lymphatique à travers l’incision, l’orientant vers la tête.

Surveillez l’extrémité proximale de la canule pendant une à deux minutes. Confirmez la réussite de la canulation en observant un écoulement lent et régulier de liquide lymphatique. Fixez la canule en appliquant une petite goutte d’adhésif tissulaire cyanoacrylate avec une pipette au site de l’incision et au trou de fixation secondaire.

Observez le flux lymphatique pendant plusieurs minutes pour confirmer un écoulement régulier. Ensuite, retirez soigneusement l’expanseur tissulaire et repositionnez la glande sous-mandibulaire à son emplacement d’origine. Fixez un tube microcentrifuge pré-marqué, recouvert d’anticoagulant, à l’extrémité distale de la canule.

Ensuite, repositionnez toutes les couches musculaires à leur emplacement d’origine, et refermez l’incision cutanée avec des points de suture et/ou de l’adhésif tissulaire. Collectez la lymphe en continu dans des tubes microcentrifuges recouverts d’anticoagulant, en les remplaçant à intervalles prédéterminés, généralement toutes les heures. Assurez-vous que le rat reste anesthésié pendant toute la période de prélèvement.

Conservez les échantillons collectés dans des poches de glace dans une glacière. Les débits lymphatiques horaires mesurés sur une période de prélèvement de six heures chez des rats canulés avec succès variaient de 0,09 à 0,13 millilitres par heure. Chez les rats en bonne santé, le transport lymphatique cumulatif de l’albumine marquée au tritium administrée par intrastriat, est resté négligeable pendant les deux premières heures et a augmenté considérablement par la suite.

La comparaison des concentrations d’albumine marquée au tritium entre la lymphe et le plasma a montré des profils de concentration différents au fil du temps chez des rats en bonne santé. La neuroinflammation induite par l’administration interpéritonéale de lipopolysaccharide d’Escherichia coli était associée à une légère réduction du débit lymphatique global sur huit heures et à une réduction de près de deux fois la proportion de la dose totale transportée dans la lymphe. Le rapport concentration lymphe/plasma n’a montré aucune différence significative entre rats sains et neuroinflammatoires, indiquant des profils de clairance lymphatique cervicale similaires.

Ce protocole permettait un échantillonnage biologique direct de la lymphe d’origine cérébrale, en faisant le lien entre l’imagerie indirecte et la méthode résineuse avec un écoulement mesurable du système nerveux central. Le protocole permet d’étudier l’élimination des médicaments administrée centralement via les voies lymphatiques, permettant de mesurer les voies de drainage et les taux de dégagement. De futures études pourront examiner comment les états de maladies du SNC alertent sur la clairance lymphatique et utiliser ces connaissances pour optimiser les médicaments afin de restaurer la fonction lymphatique cérébrale en vue du traitement.