Cartographie de l’immunité infantile avec un apport minimal : profilage intégratif unicellulaire et multiomique

Nos recherches définissent comment l’immunité précoce s’adapte après la naissance en utilisant un profilage multiomique longitudinal à haute dimension à partir de petits volumes sanguins. Ce protocole peut être appliqué aux études néonatales et pédiatriques pour le profilage immunitaire longitudinal à partir de bioéchantillons limités à travers la santé, l’infection et l’inflammation. Pour commencer, décongelez rapidement un flacon contenant des globules rouges lysés de nourrissons dans un bain-marie à 37 degrés Celsius.

Transférer les cellules décongelées dans un tube conique de 15 millilitres contenant 10 millilitres de milieu RPMI complet et tiède à 37 degrés Celsius. Centrifugez le tube à 400 g pendant cinq minutes à température ambiante, puis jetez le surnageant. Resuspendez la pastille cellulaire dans trois millilitres de milieu RPMI complet et comptez le nombre total de cellules.

Diluez l’échantillon si la concentration est trop élevée pour être comptée. Après le comptage des cellules, répétez l’étape de centrifugation et resuspendez les cellules dans un milieu RPMI complet pour obtenir une concentration d’un million de cellules par millilitre. Transférez 100 microlitres contenant 0,1 million de cellules dans chaque puits d’une plaque à fond en V à 96 puits.

Centrifugez la plaque à 764 g pendant deux minutes à quatre degrés Celsius. Jetez le surnageant. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de colorant vivant mort dilué de un à 2 000 en PBS avec le bloc FC et le bloc monocyte dilués de un à 100 à tous les échantillons sauf le témoin non coloré.

Écouver les échantillons pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius. Pour laver les cellules, ajoutez 100 microlitres de PBS. Centrifugez la plaque à 764 g pendant deux minutes à quatre degrés Celsius, puis jetez soigneusement le surnageant.

Ajouter 100 microlitres de cocktail d’anticorps de surface, dilué d’un à 200 dans un tampon cellulaire activé par fluorescence, ou tampon FACS, à tous les échantillons sauf le témoin non coloré. Incubez pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Ensuite, lavez les cellules avec 100 microlitres de tampon FACS, centrifugez et jetez le surnageant.

Fixez les cellules en ajoutant 100 microlitres de paraformodéhyde à 4 % à chaque échantillon. Incubez pendant 15 minutes à température ambiante dans le noir, puis lavez à nouveau les cellules, puis resuspendez dans 200 microlitres de tampon FACS. Préparez les billes de compensation UltraComp comme des commandes monocolores.

Colorez les billes de contrôle monocolore en suivant la même procédure que les échantillons, y compris la fixation si les échantillons étaient fixes. Préparez aussi la fluorescence sans un ou les contrôles FMO de la même manière. Effectuez les échantillons, contrôles monocolore, contrôles non colorés et contrôles fluorescent-moins un sur un cytomètre à flux conventionnel ou spectral.

Ouvrez FlowJo et sélectionnez l’échantillon d’intérêt à analyser. Définir les portes en utilisant les contrôles d’isotype et FMO appropriés. Utilisez les leucocytes à grilles en utilisant FSC versus SSC pour exclure les débris, et sélectionnez les cellules par taille et granularité.

Excluez les doublets en utilisant FSCA versus FSCH. Faites griller les cellules vivantes à l’aide d’un colorant de viabilité pour exclure les cellules mortes. À partir de cellules uniques vivantes, se divisent en lymphocytes CD33 négatifs et cellules myéloïdes CD33-positives.

Dans les cellules CD33-positives, identifiez les monocytes CD14-positifs. Ensuite, dans les cellules CD33-positives, identifiez les cellules dendritiques CD14-négatives et CD11C-positives. Aujourd’hui, parmi les lymphocytes CD33 négatifs déplacent les cellules T CD3-positives et les cellules naturelles tueuses CD3-négatives CD56-positives.

Au sein des cellules T CD3-positives, identifier les sous-ensembles CD8-positifs et CD4-positifs, ainsi que les cellules B CD3-négatives, CD56-négatives et CD19-positives. Pour commencer, décongelez un flacon de cellules lysées par des globules rouges cryo-conservés dans un bain-marie à 37 degrés Celsius. Transférer la suspension dans un tube conique de 15 millilitres contenant 10 millilitres de milieu T-lymphocyte et centrifuger à 430 g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.

Jetez le surnageant. Après avoir resuspendu la granule cellulaire avec un millilitre de PBS, ajoutez neuf millilitres supplémentaires de PBS à l’échantillon. Centrifugez le tube à 430 g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius et jetez le surnageant.

Comptez les cellules et évaluez la viabilité en utilisant l’exclusion du bleu de trypan. Si la viabilité est inférieure à 70 %, utilisez un kit d’extraction de cellules mortes comme suit. D’abord, préparez un tampon à 1x liaison en diluant la solution de tampon 20x liaison avec de l’eau stérile doublement distillée.

Resuspendez la granule cellulaire dans 100 microlitres de microperles d’élimination des cellules mortes par 10 pour atteindre la puissance totale de sept cellules. Mélangez bien et faites éclore pendant 15 minutes à température ambiante. Placez la colonne de séparation magnétique dans le support magnétique approprié, ainsi qu’un tube de collecte.

Ensuite, équilibrez la colonne en rinçant avec 500 microlitres de tampon à liaison 1x. Amenez le volume de suspension de la cellule à 500 microlitres avec un tampon de liaison 1x. Après avoir remplacé le tube de collecte, appliquez la suspension de la cellule sur la colonne et collectez le flux dans le nouveau tube microcentrifuge de 1,7 millilitre.

Ensuite, lavez la colonne deux fois avec 500 microlitres de tampon de liaison et collectez le flux dans le même tube de microcentrifugeuse. Centrifugez l’éluat à 300 g pendant 10 minutes et jetez le surnageant. Comptez les cellules et évaluez à nouveau la viabilité en utilisant l’exclusion du bleu de trypan.

Une aliquote de 20 000 cellules viables dans un nouveau tube microcentrifuge de 1,7 millilitre. Ensuite, centrifugez les cellules à 300 g pendant 10 minutes et retirez le surnageant. Resuspendez les cellules avec 40 microlitres de PBS contenant 0,04 % de BSA.

Enfin, placez le tube contenant les cellules sur la glace et envoyez-le immédiatement à une installation de noyau génomique pour la génération et le séquençage de la bibliothèque. Collectez les résultats de séquençage au format des sorties du cell ranger. Des échantillons de taches de sang séché provenant de nourrissons prématurés et de témoins ont été traités.

Et l’expression normalisée des protéines de 92 protéines liées au système immunitaire a été quantifiée. L’expression du gène trois d’activation des lymphocytes et de l’adaptateur transmembranaire 1 régulant le seuil de signalisation était significativement plus élevée dans le sang périphérique chez les nourrissons prématurés à deux mois par rapport au sang de cordon à terme. Une stratégie de contrôle complète a été utilisée pour identifier les populations de leucocytes à partir d’échantillons de globules blancs lysés par les globules rouges.

Au sein de la population de lymphocytes T, les sous-ensembles positifs au niveau du jour au jour du jour ont été distingués. Après filtrage, plus de 120 000 cellules ont été capturées et profilées dans le jeu de données de séquençage de l’acide ribonucléique unicellulaire. La réduction de dimensionnalité et l’analyse de regroupement ont permis d’identifier 14 grappes cellulaires distinctes.

Les groupes cellulaires étaient annotés en fonction de gènes exprimés différemment et de marqueurs cellulaires connus. 12 des 14 groupes correspondaient à des lignées cellulaires immunitaires, incluant les cellules T, les cellules tueuses naturelles, les cellules B, les cellules myéloïdes et les neutrophiles. Un graphique à barres empilées illustrait la proportion relative de cellules par grappe sur une semaine, un mois et deux mois d’âge.

Cette étude permet de mesurer longitudinalement les signatures immunitaires cellulaires, transcriptomiques, protéomiques et fonctionnelles à partir d’échantillons sanguins à volume limité. De futures études pourront utiliser ces méthodes pour définir des trajectoires immunitaires saines et découvrir des réponses immunitaires dérégulées en début de vie liées aux maladies.