Une technique pour stabiliser les protéines membranaires dans les nanodisques

Ce protocole met en avant un flux de reconstitution reproductible de nanodisques avec un cadre de méthode générée. Les détergents déstabilisent les protéines membranaires. Les nanodisques contenant des MSP et des lipides perçoivent la structure native pour la cryo-EM et la lyse.

Commencez par ajouter les composants lipidiques préparés en chloroforme dans un tube à essai en verre pour préparer un mélange lipidique de 100 microlitres et mélangez soigneusement. Évaporez le chloroforme sous un doux jet d’azote jusqu’à ce que tout liquide soit éliminé. Ajoutez environ deux millilitres de n-pentane goutte dans le tube à essai en verre et évaporez le solvant à l’aide d’azote pour obtenir un film lipidique sec et transparent.

Après avoir desserré le bouchon du tube, placez le tube dans le dessicateur à vide. Évacuez le dessiccateur et maintenez-le sous vide pour éliminer les solvants résiduels. Ensuite, retirez le film lipidique du dessiccateur sous vide et ajoutez 250 microlitres de tampon sans détergent et faible en sel pour hydrater le film lipidique, obtenant ainsi une concentration lipidique finale de 10 milligrammes par millilitre.

Après avoir résuspendu les lipides, divisez-les uniformément en quatre tubes en verre. Sonicez les suspensions jusqu’à ce qu’elles deviennent claires et transparentes, indiquant la formation réussie des liposomes. Ensuite, rincez immédiatement l’espace de tête de chaque tube avec de l’azote et conservez à moins 80 degrés Celsius jusqu’à utilisation.

Après transformation des cellules BL21 d’E.coli avec le plasmide MSP1D1, portant une marque de 7-histidine et une expansion en culture qui en subscou. Induire l’expression du MSP en ajoutant l’IPTG à une concentration finale de 0,5 à un millimolaire. Ensuite, continuez à cultiver les cellules à 16 degrés Celsius pendant 16 à 20 heures en faisant des secousses.

Centrifugez la culture bactérienne à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Écartez le surnageant et conservez la pastille cellulaire. Ensuite, resuspendez le pellet issu d’un litre de culture dans 100 à 150 millilitres de tampon de lyse.

Homogénéisez soigneusement jusqu’à obtenir une suspension uniforme sans amas visibles. Ensuite, utilisez un perturbateur à cellules ultrasonores réfrigérées pour briser la bactérie à 35 % de puissance avec des cycles d’impulsions de trois secondes, suivis de pauses de six secondes. Continuez à sonicer jusqu’à ce que le lysat devienne clair et brun clair.

Centrifugez le lysat à 30 000g pendant 45 minutes à quatre degrés Celsius, puis collectez le surnageant pour les étapes suivantes. Après incubation du surnageant avec une résine nickel-NTA équilibrée et lavage pour éliminer les impuretés, éluvez la protéine cible avec le tampon d’élution et collectez les fractions éluées. Continuez à collecter des fractions jusqu’à ce que l’absorption de l’éluat à 280 nanomètres descende en dessous de 0,01.

Ensuite, transférez l’éluate en pool dans un tube de dialyse, puis dialysez-le contre le tampon de dialyse à quatre degrés Celsius en remuant doucement toute la nuit. Après la dialyse, concentrez la solution à l’aide d’un dispositif d’ultra-filtration pour obtenir une concentration finale de MSP de deux à cinq milligrammes par millilitre. Pèser environ 250 milligrammes de bio-billes dans un tube centrifugeuse de 50 millilitres.

Ajoutez 25 à 30 millilitres de méthanol au tube. Faites tourner ou faire tourner le mélange en vortex dans l’obscurité. Après avoir incubé le tube à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes, jetez soigneusement le surnageant et répétez le lavage au méthanol deux fois de plus.

Effectuez des lavages similaires avec de l’eau double distillée trois fois, puis ajoutez 25 à 30 millilitres de tampon sans détergent et faible en sel aux billes. Secouez ou faites pivoter le tube sur une table rotative pour mélanger et incuber, comme démontré précédemment. Écartez le surnageant et répétez l’étape d’équilibrage du tampon à faible teneur en sel trois fois pour conditionner complètement les biles.

Divisez les bio-billes activées également en trois tubes microcentrifuges de 1,5 millilitre pour un usage ultérieur. Récupérez une aliquote du fond lipidique pré-préparé et décongelez-le. Immédiatement, centrifugez le tube à 7 000g pendant cinq secondes à quatre degrés Celsius pour recueillir le contenu au fond.

Ultrasoniser le stock lipidique dans un bain-marie à 60 % d’amplitude et surveillez la clarté et la température toutes les cinq à dix minutes pour éviter la surchauffe. Continuez la sonication jusqu’à ce que le fond lipidique devienne clair et transparent. Calculez la quantité molaire de la protéine membranaire cible à l’aide de l’équation présentée.

Calculez ensuite les volumes requis de solutions MSP et de stocks lipidiques en fonction d’un rapport stœchiométrique molaire de la protéine cible, MSP et lipide de un à cinq à 250. Combinez les volumes correspondants de lipides et de MSP pour préparer un mélange maître de 300 microlitres et incubez sur glace pendant 10 minutes. Ajoutez ensuite lentement 50 microlitres du mélange à la solution protéique concentrée tout en pipettant doucement pour assurer l’homogénéité.

Ensuite, placez le mélange combiné sur de la glace pendant une heure, puis inversez doucement le tube toutes les 15 minutes pour bien mélanger. Maintenant, prenez une aliquote des bio-billes préactivées et aspirez le tampon résiduel pauvre en sel. Ajoutez la solution protéique aux billes et incubez en rotation dans le noir pendant une heure à quatre degrés Celsius.

Centrifugez le mélange à 7 000g pendant cinq secondes à quatre degrés Celsius. Transférez soigneusement le surnageant sur une seconde aliquote de bio-billes d’où le tampon faible en sel a été aspiré. Après avoir bien mélangé le contenu par inversion douce, faites couver dans le noir pendant quatre à huit heures ou toute la nuit.

Une fois la solution protéique brièvement centrifugée, transférer le surnageant vers la troisième aliquote de bio-billes pré-activées. Incubez en rotation à quatre degrés Celsius dans le noir pendant une heure. Après une courte centrifugation, transférez le surnageant dans un tube propre de microcentrifuge.

Centrifugez à 17 000g à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes pour retirer les granulats. Après avoir purifié les complexes nanodisques TASK2 par chromatographie d’exclusion de taille, regroupez les fractions maximales de l’élution et concentrez-les jusqu’à une concentration finale de nanodisque TASK2 de 1,2 à 1,5 milligramme par millilitre. Pour vérifier l’assemblage du nanodisque, analysez les échantillons à l’aide de SDS-PAGE à 12 % et confirmez la présence de MSP et de la protéine membranaire cible.

Le profil chromatographie d’exclusion de taille a montré deux pics majeurs correspondant au complexe de nanodisques assemblé à 15,1 millilitres et au MSP libre à 18,0 millilitres. La quantification des surfaces de pic a montré que le pic du nanodisque assemblé avait une surface de 147,2. En revanche, le pic du MSP libre avait une surface de 31,5, correspondant à une efficacité d’assemblage de 82,4 % La comigration de la protéine cible et le MSP dans SDS-PAGE confirmaient leur incorporation dans un seul complexe de nanodisques.

Ce protocole aide les chercheurs à étudier la structure des protéines membranaires en utilisant la constitution en nanodisques. La partie la plus difficile est d’optimiser le rapport entre la protéine membranaire, le MSP et les lipides. Des tests fonctionnels, la résonance plasmonique de surface et la spectrométrie de masse peuvent également être réalisés grâce à cette procédure.