Un modèle de lésion hypoxie-réoxygénation chez les cardioïdes humains auto-assemblants

Nos recherches visent à trouver de nouvelles façons d’aider le cœur à se régénérer après une blessure. Pour cela, nous générons des organoïdes cardiaques auto-assemblants et réalisons des études de réoxygénation hypoxique. Ce protocole peut être appliqué à l’étude de la réponse aux blessures, aux interventions thérapeutiques favorisant la régénération, et peut être utilisé pour la modélisation spécifique des maladies à chaque patient.

Pour commencer, aspirez le milieu de spécification du mésoderme cardiaque D1 et ajoutez suffisamment de solution de décollement cellulaire pour couvrir entièrement les cellules cardiaques dérivées des cellules souches pluripotentes induites par l’humain. Ensuite, placez l’assiette dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. À l’aide d’une pipette, ajoutez un volume égal de milieux mésodermiques cardiaques D2 à chaque puits et pipetez doucement de haut en bas pour libérer les cellules adhérentes, transférez la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 millilitres.

À l’aide d’une centrifugeuse, pelletez les cellules à 300 G pendant trois minutes à température ambiante. Resuspendez la pellete dans un millilitre de milieu de spécification du mésoderme cardiaque D2 contenant cinq micromolaires IWP-2 et 50 microgrammes par millilitre d’acide ascorbique en RB moins. Mélangez 10 microlitres de bleu de trypan avec 10 microlitres de suspension cellulaire dans un microtube.

Compter les cellules en utilisant la méthode de comptage préférée, puis diluer les cellules à une concentration de 100 000 cellules par millilitre dans un milieu de spécification du mésoderme cardiaque D2 complété par deux micromolaires thiazovivine. Transférez la suspension de la cellule dans un réservoir de réactif de taille appropriée. Ensuite, à l’aide d’une pipette multicanal, distribuez 100 microlitres dans chaque puits d’une plaque d’attachement ultra-faible à 96 puits pour atteindre une concentration finale de 10 000 cellules par puits.

Faites tourner la plaque à 500 G pendant cinq minutes à température ambiante pour induire la formation d’organoïdes cardiaques humains en culture en suspension. Observez la formation d’une grande pellete cellulaire bien circonscrite dans chaque puits. Si la pellete n’est pas circonscrite, répétez la centrifugation.

Après 24 heures, préparez 10 millilitres de milieu D3 contenant cinq micromolaires IWP-2 et 50 microgrammes par millilitre d’acide ascorbique en RB moins par plaque. À l’aide d’une pipette multicanal, ajoutez 100 microlitres de média D3 à chaque puits sans retirer aucun support existant. Le lendemain, retirez 100 microlitres de média D3 de chaque puits.

Pour minimiser le risque d’aspiration, inclinez la plaque à un angle de 45 degrés et maintenez une pipette multicanal à un angle de 90 degrés par rapport à la paroi latérale de la plaque. Placez la pipette fermement sur la paroi du puits et aspirez lentement. Après avoir retiré le mieux, remplacez-le par 100 microlitres de milieu D4 contenant cinq micromolaires IWP-2 en RB moins.

À l’aide d’une pipette de 1 000 microlitre dont la pointe est coupée, transférez les organoïdes cardiaques humains dans un tube microcentrifuge de 1,7 millilitre. Laissez les organoïdes s’enfoncer au fond du tube et retirez doucement l’excès de milieu. Ajoutez une solution de solution physiologique tamponnée phosphate pour laver les organoïdes une fois.

Attendez quelques secondes qu’ils coulent, puis retirez doucement l’excès de PBS. Ensuite, ajoutez 4 % de paraformoldéhyde pour fixer les organoïdes et placez le tube à température ambiante pendant 30 minutes pour permettre la fixation. Ensuite, transférez le nombre désiré d’organoïdes fixes dans un tube microcentrifuge de 1,7 millilitre.

Retirez la solution fixative et lavez les organoïdes avec du PBS contenant 0,1 % de Tween 20. Préparez la solution primaire d’anticorps en diluant l’anticorps à la concentration souhaitée dans la solution colorante. À l’aide d’une pipette, ajoutez 50 à 100 microlitres de la solution primaire d’anticorps à chaque tube de microcentrifuge, afin de garantir que les organoïdes sont entièrement couverts.

Après l’incubation et les lavages ultérieurs, incubez l’échantillon avec un anticorps secondaire dilué dans une solution colorante pendant 24 heures à quatre degrés Celsius sur une plateforme de secouement. Après l’incubation, effectuez les lavages comme décrit précédemment. Ensuite, à l’aide d’une pointe de pipette coupée, transférez les organoïdes sur une lame en verre chargée positivement.

Retirez doucement l’excès de PBS avec Tween 20 et ajoutez quelques gouttes de support de montage pour couvrir les organoïdes. Placez soigneusement une gaine de couverture sur les organoïdes pour les aplatir. Ensuite, procéder à la microscopie à fluorescence.

Après avoir incubé les organoïdes fixés toute la nuit dans 30 % de saccharose à quatre degrés Celsius, transférez-les dans un moule en plastique et ajoutez une petite goutte de composé à température de coupe optimale au moule, juste assez pour recouvrir les organoïdes. À l’aide d’une pince fine ou d’une pointe de pipette, repositionnez doucement les organoïdes dans le composé afin qu’ils ne s’agglomèrent pas et soient éloignés des bords du moule. Placez les organoïdes aussi près que possible du fond du moule pour maximiser le nombre présent dans une seule cryosection.

Placez le moule dans un refroidisseur en polystyrène contenant une couche de glace sèche pour congeler la première couche de composé optimal à température de coupe. Attendez quelques minutes que le composé durcisse, puis déplacez le moule sur le plan de travail. Ajoutez un composé supplémentaire à température de coupe optimale jusqu’à ce que le moule soit rempli.

Laissez fondre complètement la première couche avant de remettre le moule sur la glace sèche pour la congélation complète. Une fois congelés, conservez les moules à moins 80 degrés Celsius ou procédez à la cryosection pour obtenir des sections de six micromètres. À l’aide d’une pipette, transférez cinq millilitres de milieu hypoxique par plaque organoïde cardiaque humaine à 96 puits dans un flasque de culture cellulaire.

Placez la fiole dans une chambre d’hypoxie et rinçez la chambre avec un gaz anoxique composé de 5 % de dioxyde de carbone et 95 % d’azote pendant trois minutes. Placez la chambre dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant au moins une heure avant d’initier l’hypoxie. À l’aide d’une pipette multicanal, retirez environ 150 microlitres de milieux de tous les puits de la plaque organoïde cardiaque humaine.

Ensuite, à l’aide d’une pipette de 200 microlitres, retirez soigneusement le reste du milieu de chaque puits individuel sans déranger les organoïdes. Ajoutez 50 microlitres de milieux hypoxiques à chaque puits. Placez la plaque organoïde cardiaque humaine dans la chambre hypoxique.

Et rincer la chambre avec un gaz anoxique composé de 5 % de dioxyde de carbone et 95 % d’azote pendant trois minutes. Placez la chambre d’hypoxie dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant six heures. Pour initier la réoxygénation, retirez les organoïdes cardiaques humains de la chambre d’hypoxie.

À l’aide d’une pipette multicanal, ajoutez 150 microlitres de RB+media préchauffé à chaque puits. Enfin, placez la plaque dans un incubateur à 37 degrés Celsius et laissez au moins trois heures de réoxygénation avant d’effectuer des tests en aval. Après six heures d’hypoxie et 24 heures de reperfusion, l’activité extracellulaire lactate déshydrogénase a été significativement augmentée chez les organoïdes cardiaques humains lésés par rapport aux témoins non blessés.

Les organoïdes cardiaques traités par hypoxie présentaient des noyaux cardiomyocytaires positifs à TUNEL, et le pourcentage de noyaux cardiomyocytes positifs à TUNEL était significativement plus élevé chez les organoïdes blessés que chez les témoins non blessés. Une augmentation dépendante du temps de la formation des cicatrices a été observée avec une durée croissante de l’hypoxie avant la réoxygénation. À 24 heures après la réperfusion, 69 % des organoïdes cardiaques humains non blessés battaient, tandis qu’aucun organoïde blessé ne battait.

Les organoïdes cardiaques humains non blessés présentaient des transitoires calciques synchronisés dans cinq régions d’intérêt, avec des pics survenant simultanément et avec des formes d’onde similaires. Les organoïdes cardiaques humains blessés n’ont pas présenté de contractions coordonnées et ont plutôt montré des transitoires calciques spontanés irréguliers dans les régions d’intérêt. Ce protocole permet aux chercheurs d’imiter l’infarctus du myocarde chez des organoïdes cardiaques humains dérivés de l’iPSC.

Le plus grand défi technique pour garantir la rédemption des blessures est la suppression complète des supports existants. Nos futures études visent à identifier les facteurs pouvant favoriser la régénération tissulaire chez des modèles organoïdes cardiaques humains.