Prélèvement d’ADN environnemental sur des navires d’observation des baleines pour la surveillance des cétacés

Ce protocole offre une approche standardisée pour l’échantillonnage de l’ADN électronique des baleines lors des croisières d’observation des baleines. De nombreuses méthodes différentes d’échantillonnage d’ADN électronique sont disponibles. Cela entrave l’analyse comparative des données.

Notre protocole a été optimisé selon les conditions environnementales et garantit les protections contre la contamination. Avec le soutien d’un laboratoire radio eADN, ce protocole peut être mis en œuvre par des non-experts et des citoyens scientifiques lors des activités d’observation des baleines et à travers le monde. Pour commencer, préparez les documents de terrain, y compris les fiches techniques de terrain et le protocole de terrain laminé étape par étape pour l’échantillonnage d’ADN environnemental des cétacés.

Mettez un marqueur imperméable, deux filtres eADN par empreinte de fluke, un nombre suffisant de gants et un contenant dédié aux déchets dans la boîte. Préparez un ou plusieurs seaux rigides adaptés au type de navire et à la configuration embarquée, un contenant secondaire d’ADN environnemental, et une pompe à eau péristaltique ou à vide portable. Portez des gants lors de toute manipulation du matériel et changez de gants entre les tâches.

Pour stériliser l’équipement, appliquez une solution d’eau de Javel ménagère diluée en éclaboussant uniformément toutes les surfaces des seaux, des couvercles, des contenants et des tubes de pompe. Rincez soigneusement avec de l’eau du robinet trois fois. Emmenez tout le matériel à bord avant l’arrivée des passagers et rangez-le dans une zone propre désignée.

Coordonnez le moment d’échantillonnage et le positionnement du navire avec l’équipage du navire. Observez les motifs de surface sur l’eau pour anticiper les plongées de baleine. Collectez 20 litres d’eau de mer sur l’empreinte de la douche dès que possible, en assurant un délai de 10 minutes après la plongée de la baleine.

Prélève des échantillons dans différentes régions en utilisant des conditions logistiques personnalisées adaptées à chaque lieu et type de navire. Si nécessaire, transportez l’eau collectée vers une station de filtration désignée à bord, évitant ainsi les déversements. Notez l’identité de l’espèce, les coordonnées du système de positionnement géographique, l’heure et l’identification des répliques d’échantillons dans la fiche technique.

Changez les gants avant la filtration. Ouvre le sac filtre et ne manipule le filtre qu’à la sortie. Insérez l’entrée dans le tuba, puis connectez le tuyau de la pompe à la sortie.

Immergez le tuba dans l’échantillon d’eau sans immerger le boîtier du filtre, puis réglez la pompe sur un débit rapide et constant. Filtrez 10 litres en continu tout en surveillant la stabilité du débit. Ensuite, inversez le filtre et faites tourner la pompe pendant 30 à 60 secondes pour éliminer l’eau résiduelle.

Personnalisez la configuration de la pompe de filtrage selon les conditions du terrain. Coupez la pompe et débranchez la tubulure. Placez le filtre dans son sac d’origine et étiquetez-le immédiatement.

Changez de gants et préparez-vous à effectuer la filtration pour la deuxième réplication. Conservez les filtres à ADN environnementaux auto-conservants dans un récipient sûr et sec, dans une pièce ombragée à température ambiante. Réfrigérez les filtres si la température ambiante dépasse 20 degrés Celsius et expédiez dans les trois mois.

Effectuer toutes les procédures de laboratoire dans des pièces dédiées à la stérilisation aux ultraviolets avec une ventilation adéquate. Après avoir enfilé des gants et des vêtements de protection sans ADN, nettoyez soigneusement les établis. À l’aide de pinces sans ADN, pliez la membrane filtrante en triangles et transférez-la dans un tube de réaction de deux millilitres avec la pointe orientée vers le bas.

Ajouter un tampon de lyse de 400 microlitres composé de 380 microlitres tampon TES et 20 microlitres de protéinase K à chaque tube de réaction. Vortex brièvement et incubation à 56 degrés Celsius pendant au moins trois heures avec agitation. Placez le filtre dans une entrée en plastique avec un fond perforé et centrifugez à 18, 626 g pendant 10 minutes à température ambiante pour séparer le tampon de lyse du filtre.

Réactifs d’extraction par pipette dans des plaques de lavage et des plaques d’élution. Utilisez plusieurs plaques de liaison si le volume total du lysat dépasse 300 microlitres. Utilisez des particules magnétiques vortex, et ajoutez 30 microlitres par puits dans la première plaque de liaison.

Exécutez le programme préliminaire d’absorption de l’ADN pour deux plaques de liaison et le programme d’extraction d’ADN qui suit sur le robot. Pour exécuter toutes les réactions QPCR en triple exemplaire, préparez le master mix requis dans un espace de travail dédié et répartiez-le entre les puits. Ajoutez trois microlitres d’extrait d’ADN standard cible ou d’eADN à chaque puits.

Après avoir scellé la plaque PCR préparée, centrifugez-la à 3 500 G pendant 10 secondes, puis la plaque dans le thermocycleur quantitatif en temps réel. Enfin, effectuez le test dans des conditions de cyclage optimisées. 247 échantillons d’ADN environnemental ou eDNA ont été prélevés dans la baie de Skjalfandi, en Islande, et aux Açores, impliquant la collecte de jusqu’à 10 litres d’eau de mer avec deux filtres eADN auto-conservants par empreinte de fluke.

Parmi les 44 filtres à ADN électronique analysés pour l’ADN électronique de baleine à bosse, 20 ont produit des signaux d’amplification, tandis que 24 n’ont montré aucune amplification. Les blanks d’extraction, les contrôles de champ et les contrôles quantitatifs par PCR n’ont montré aucune amplification détectable, indiquant une absence de contamination. Parmi les réactions positives, neuf filtres à ADN électronique ont donné au moins une valeur seuil de cycle en dessous de la limite de détection, et ont été classés comme des détections fiables.

Les 11 filtres EDNA restants produisaient des valeurs de seuil de cycle supérieures à la limite de détection indiquant des détections plausibles. La valeur seuil moyenne du cycle était légèrement inférieure dans les filtres eADN des Açores, à environ 34,7, comparée aux filtres islandais avec une valeur d’environ 36,9. La différence dans les valeurs de seuil de cycle entre les filtres eADN des Açores et d’Islande n’était pas statistiquement significative.

Ce protocole peut être utilisé pour de futures campagnes d’échantillonnage d’ADN électronique à grande échelle afin d’étudier la biodiversité marine ou la génétique des populations de baleines. Ce protocole permet la détection et le suivi non invasifs des taxons des cétacés et des concurrents via l’ADN numérique contenu dans les empreintes de flukebags collectées sur des navires d’observation des baleines.