Name: Essai de cytométrie en flux multiplex basé sur billes pour le profilage fonctionnel des cellules CAR T (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-07-10T12:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Découvrez un essai multiplex basé sur billes pour le profilage fonctionnel des cellules CAR T humaines par cytométrie en flux. Cette méthode permet la détection simultanée de multiples médiateurs effecteurs à partir d'échantillons limités.

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<ol><li>Biery, D. N., Turicek, D. P., Diorio, C., Schroeder, B. A., Shah, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Need+for+standardization+of+cytokine+profiling+in+CAR+T+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Need for standardization of cytokine profiling in CAR T cell therapy.</a> Mol Ther. 32 (9), 2979-2983 (2024).</li>
<li>Boulch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cross-talk+between+CAR+T+cell+subsets+and+the+tumor+microenvironment+is+essential+for+sustained+cytotoxic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Immunol%22%5BJournal%5D)">A cross-talk between CAR T cell subsets and the tumor microenvironment is essential for sustained cytotoxic activity.</a> Sci Immunol. 6 (57), eabd4344(2021).</li>
<li>Teachey, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+predictive+biomarkers+for+cytokine+release+syndrome+after+chimeric+antigen+receptor+T-cell+therapy+for+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Identification of predictive biomarkers for cytokine release syndrome after chimeric antigen receptor T-cell therapy for acute lymphoblastic leukemia.</a> Cancer Discov. 6 (6), 664-679 (2016).</li>
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<li>Leng, S. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ELISA+and+multiplex+technologies+for+cytokine+measurement+in+inflammation+and+aging+research%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gerontol+A+Biol+Sci+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">ELISA and multiplex technologies for cytokine measurement in inflammation and aging research.</a> J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 63 (8), 879-884 (2008).</li>
<li>Tighe, P. J., Ryder, R. R., Todd, I., Fairclough, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ELISA+in+the+multiplex+era%3A+Potentials+and+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics+Clin+Appl%22%5BJournal%5D)">ELISA in the multiplex era: Potentials and pitfalls.</a> Proteomics Clin Appl. 9 (3–4), 406-422 (2015).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+targets%3A+a+versatile+cell%E2%80%91free+platform+to+characterize+CAR+T+cell+function+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Artificial targets: a versatile cell‑free platform to characterize CAR T cell function in vitro.</a> Front Immunol. 15, 1254162(2024).</li>
<li>Ren, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+co%E2%80%91culture+model+with+CAR%E2%80%91T+cells%2C+antigen%E2%80%91presenting+cells%2C+and+tumor+cells+to+evaluate+CAR%E2%80%91T+cell%E2%80%91induced+cytokine+release+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Infect+Microbiol%22%5BJournal%5D)">An in vitro co‑culture model with CAR‑T cells, antigen‑presenting cells, and tumor cells to evaluate CAR‑T cell‑induced cytokine release syndrome.</a> Front Cell Infect Microbiol. 16, 1721114(2026).</li>
<li>Lock, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated%2C+scaled%2C+transposon-based+production+of+CAR+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother+Cancer%22%5BJournal%5D)">Automated, scaled, transposon-based production of CAR T cells.</a> J Immunother Cancer. 10 (9), e005189(2022).</li>
<li>Bethke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+fully+human+FOLR1-targeting+CAR+T+cells+for+the+treatment+of+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of fully human FOLR1-targeting CAR T cells for the treatment of ovarian cancer.</a> Cells. 13 (22), 1880(2024).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>MACSPlex Cytotoxic T/NK Cell Kit, human</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-125-800</td><td>Test de cytokine multiplexé basé sur des billes pour la cytométrie en flux</td></tr><tr><td>MACSPlex InspectoR Tool</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>\</td><td>Outil web pour le gating et l'analyse automatisés des données MACSPlex</td></tr><tr><td>MACSQuant Analyzer 10 Flow Cytometer</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-343</td><td>Instrument de cytométrie en flux de mesure de données multiplex</td></tr><tr><td>MACSQuant Analyzer 16 Flow Cytometer</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-109-803</td><td>Instrument de cytométrie en flux de mesure de données multiplex</td></tr><tr><td>MACSQuant Express Mode</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>\</td><td>Logiciel pour le gating et l'analyse automatisés</td></tr><tr><td>TexMACS Medium</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-196</td><td>Milieu de culture cellulaire sans sérum optimisé développé pour la culture et l'expansion des cellules T humaines et murines</td></tr></tbody></table>

essai de cytométrie en flux multiplex basé sur billes pour le profilage fonctionnel des cellules car t

Bead-Based Multiplex Flow Cytometry Assay for Functional Profiling of CAR T Cells

Essai de cytométrie en flux multiplex basé sur billes pour le profilage fonctionnel des cellules CAR T

Profiling CAR T cells presents challenges due to their heterogeneity, complex immune responses, and limited sample availability. Multiplex assays enable ...

Notre recherche se concentre sur la caractérisation fonctionnelle des cellules T CAR et a mis au point un dosage multiplex compatible avec la cytométrie en flux pour analyser la sécrétion de molécules effectrices. Cette procédure peut être appliquée à la recherche sur les cellules T CAR pour la caractérisation fonctionnelle, les études mécanistiques, les tests de contrôle qualité et l'évaluation de la puissance.Pour commencer, préparez des cultures cellulaires de lymphocytes T humains modifiés portant un récepteur d'antigène chimérique, ou cellules CAR T, avec des cellules cibles exprimant ou non l'antigène correspondant, selon un rapport effecteur-sur-cible de 2,5 pour 1. Définissez un ou plusieurs points de prélèvement du surnageant, afin d'analyser les cytokines sécrétées ou de suivre la cinétique des cytokines sur une période définie.Reconstituez l'étalon d'analyte en ajoutant 200 microlitres de tampon ou de milieu de culture cellulaire au culot et mélangez délicatement. Préparez six tubes de réactif et effectuez une série de dilutions au 1/5 de l'étalon reconstitué jusqu'à 3,2 picogrammes par millilitre ou 0,6 picogramme par millilitre. Préparez un échantillon témoin. Aux heures définies après la co-culture, centrifugez la co-culture à 300 g pendant cinq minutes à 21 degrés Celsius. Utilisez les surnageants directement ou diluez-les afin qu'ils se situent dans la plage de la courbe étalon.Pré-humidifier une plaque filtrante MACSPlex avec 200 microlitres de tampon MACSPlex par puits, puis utiliser un collecteur sous vide ou une centrifugeuse pour aspirer jusqu'à ce que les puits soient vidés. Vortexer le mélange de billes de capture afin de resuspendre complètement les billes. Ajouter 50 microlitres d'étalon ou d'échantillon et 20 microlitres de billes pré-diluées dans les puits d'une plaque filtrante 96 puits. Incuber la plaque pendant deux heures à température ambiante sous agitation à 450 tr/min, à l'abri de la lumière. Laver les puits deux fois avec 200 microlitres de tampon en utilisant un collecteur sous vide. Ajouter 100 microlitres du réactif de détection 1 pré-dilué au rapport 1 à 50 dans les puits. Incuber pendant une heure à température ambiante sous agitation à 450 tr/min, à l'abri de la lumière. Laver les puits deux fois. Ajouter 100 microlitres du réactif de détection 2 pré-dilué au rapport 1 à 50 dans les puits. Incuber pendant 30 minutes à température ambiante sous agitation à 450 tr/min, à l'abri de la lumière. Laver les puits une fois, puis resuspendre les échantillons dans 200 microlitres de tampon.Utilisez le code-barres 2D sur le flacon de billes de capture pour charger les paramètres d'acquisition dans le cytomètre en flux MACSQuant. Après vous être connecté au logiciel, sélectionnez la plaque de filtres MACSPlex comme support d'échantillons. Cliquez sur le bouton Code-barres dans la barre d'outils pour activer le lecteur de code 2D. Présentez le flacon au lecteur en orientant le code-barres vers la lumière clignotante, à une distance de 0,5 à 2,5 centimètres. Dans l'onglet Autolabel, attribuez les billes de capture comme MPx cellules T cytotoxiques humaines et cellules natural killer, puis sélectionnez Nolabel. Définissez les positions des groupes pour les dilutions sérielles de l'étalon de cellules T cytotoxiques et de cellules natural killer. Dans l'onglet Paramètres, sélectionnez le mode Express. Réglez le type sur Analyse et le mode sur MACSPlex_Standard. Appliquez ensuite un mélange doux. Attribuez de la même manière les échantillons inconnus et définissez leurs positions. Si nécessaire, regroupez les échantillons et saisissez les identifiants et descriptions des échantillons. Dans l'onglet Paramètres, sélectionnez à nouveau le mode Express. Réglez le type sur Analyse et le mode sur MACSPlex_Sample. Dans le tableau de l'expérience, vérifiez que les définitions du support sont correctes. Assurez-vous que les niveaux de liquide dans les puits de la plaque de filtration sont appropriés, puis démarrez la mesure. À l'aide des canaux phycoérythrine ou PE, fluorescéine isothiocyanate ou FITC et allophycocyanine ou APC, acquérez les données sur un cytomètre en flux équipé de lasers bleu et rouge. Vérifiez que les modèles de mode Express sont utilisés pour le positionnement automatique des portes et l'analyse des données dans le cytomètre en flux MACSQuant. En alternative, téléversez les fichiers de données FSC ou MQD vers l'outil en ligne InspectoR pour une mesure quantitative automatisée des cytokines et des résultats prêts à être exportés. Vérifiez une séparation adéquate des 12 populations distinctes de billes de capture dans le canal FITC versus PE. Appliquez la courbe standard pour calculer les concentrations en cytokines. Enfin, exportez et visualisez les résultats.Grâce au codage multiplex de billes, des groupes de billes distincts représentant des analytes individuels ont été clairement résolus sur le tracé biaxial. Après co-culture avec des cellules cibles tumorales, les cellules CAR T ont sécrété de fortes concentrations de granzyme B, d'interféron gamma ou INF-gamma, de facteur de nécrose tumorale alpha ou TNF-alpha, ainsi que de facteur de stimulation des colonies de granulocytes et de macrophages ou GM-CSF, indiquant une activation puissante et une fonction effectorielle cytotoxique. Les concentrations d'interleukine-2 ou IL-2 ont dépassé la limite supérieure de détection, ce qui est compatible avec un signal prolifératif intense. Les cytokines associées aux réponses régulatrices ou aux lymphocytes T auxiliaires alternatives, notamment l'IL-6, l'IL-10, l'IL-17A, l'IL-21 et la protéine chimiotactique des monocytes 1 ou MCP-1, étaient présentes à des niveaux faibles ou proches de la limite de détection. Les cellules CAR T ont montré une libération rapide et robuste de cytokines après reconnaissance de cibles antigéniques positives, avec une forte surexpression de granzyme B, IFN-gamma, TNF-alpha, GM-CSF et IL-2 dans un délai de 8 à 24 heures, atteignant des concentrations maximales à 48 heures. Des augmentations modérées de l'IL-6, de l'IL-17A, de l'IL-21 et de la perforine ont également été observées. L'IL-4, l'IL-10 et la MCP-1 sont restées faibles ou légèrement augmentées. Les co-cultures avec des cibles négatives pour l'antigène ont montré une induction minimale de cytokines pour tous les analytes.Ce protocole permet la quantification des cytokines, des chimiotactines et des médiateurs cytotoxiques qui reflètent l'activation des cellules CAR T et leur fonction effectrice. Les paramètres les plus importants à prendre en compte dans ce protocole sont la durée de la co-culture, le rapport effecteur/cible, la dilution des échantillons et le maintien de concentrations mesurables d'analytes. Après cette procédure, le profilage du surnageant peut être associé à des analyses cytométriques en flux, au phénotypage des cellules CAR T ou à des tests de cytotoxicité.

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