Génération du modèle souris à activation immunitaire maternelle précoce pour évaluer l’inflammation prénatale sur le neurodéveloppement

Notre laboratoire étudie comment l’inflammation prénatale modifie la biologie des microglies, les cellules immunitaires du cerveau contribuant à des résultats neurodéveloppementaux néfastes. Les modèles existants d’IM se concentrent sur la période de gestation intermédiaire. Cependant, nous présentons un protocole gestationnel précoce qui intègre en outre des indicateurs de contrôle qualité pour améliorer la survie et la constance.

Le modèle peut être appliqué à tout type sauvage ou modèle génétique de souris pour explorer l’impact de l’inflammation environnementale sur le développement cérébral. Pour commencer, installez deux femelles C57 BL6 âgées de huit à dix semaines avec des mâles éleveurs de C57 BL6 en fin d’après-midi ou en soirée. Le lendemain matin, évaluez les souris femelles pour détecter des bouchons vaginaux et continuez à vérifier une fois par jour jusqu’à ce que le bouchon survienne.

Les bougies sont temporaires et peuvent tomber dans l’après-midi, si elles ne sont pas vérifiées le matin. Après confirmation de la présence d’un bouchon vaginal, peser la souris femelle et noter le poids pour surveiller le statut de grossesse en suivant la prise de poids sur la gestation. Séparer les femelles branchées dans des cages individuelles et les maintenir dans des conditions de logement standard avec un accès ad libidum à la nourriture et à l’eau.

Désigner les femelles bouchées comme jour embryonnaire 0,5 et noter la date du plug vaginal afin d’assurer un suivi précis de l’âge gestationnel. Pour reconstituer le poly IC lyophilisé en une solution de stock à haute concentration, dissouds-le dans une solution saline stérile ou de l’eau stérile selon les instructions du fabricant. Vortex, la solution d’action à haute concentration.

Ensuite, diluez la solution dans du sérum pour préparer un stock à faible concentration. Pour éviter les cycles répétés de congélation et de décongélation, il faut ajouter environ 125 microlitres de la réserve de basse concentration dans des tubes de 1,5 millilitre, et stocker les tubes à 20 degrés Celsius ou 80 degrés Celsius. Juste avant l’injection, le jour embryonnaire 9,5.

Diluez le poly IC à faible concentration avec du sérum stérile pour obtenir une concentration de travail. Chauffez la pièce de travail à 65 degrés Celsius pendant 10 minutes pour assurer un correctement réenalage de la structure de l’acide ribonucléique double brin. Ensuite, on utilise un vortex ou une pipette pour assurer un mélange homogène avant l’injection.

Pour confirmer la grossesse, peser la digue le matin du jour embryonnaire 9,5. Calculez le volume d’injection poly-IC pour l’activation immunitaire maternelle, ou MIA, et le volume d’injection saline à 0,9 % pour les témoins. Prélever le volume approprié de la solution de travail poly-IC préparée ou du sérum physiologique dans une seringue stérile de calibre 27 ou plus petite.

Maintenant, attachez correctement le barrage pour minimiser la douleur et la détresse. Injectez l’acide poly-IC ou la solution saline intrapéritonéalement dans le quadrant inférieur gauche ou droit, juste au-dessus du niveau de la hanche ou au niveau du second groupe de mamelons. Ensuite, jetez les seringues dans un contenant BioSafety Sharps.

Enregistrez également la partie injection pour maintenir la cohérence au sein de la cohorte. Ramenez immédiatement la mère dans la cage et surveillez tout signe de détresse. Ensuite, complétez la cage avec de l’hydrogel pendant au moins 24 heures après l’injection pour éviter la déshydratation associée à un comportement de maladie.

Ensuite, notez le volume injecté de la dose poly-IC, la date et l’heure de l’injection, l’âge gestationnel et le numéro de lot du poly-IC. Trois heures après l’injection, observez chaque souris individuellement pendant une minute et évaluez des comportements tels que la diminution de l’activité, la posture voûtée, les grimaces faciales ou les selles liquides à l’aide d’une échelle à trois points. Classez les souris présentant un ou plusieurs de ces comportements comme présentant des comportements de maladie aiguë.

Ensuite, en utilisant une méthode peu invasive comme le saignement de queue, prélève soigneusement le sang maternel de la digue injectée. Prélève environ 50 microlitres de sang. Après confirmation de l’hémostasie, remettez la digue dans la cage principale.

Laissez le sang collecté coaguler pendant 30 minutes à température ambiante. Centrifugez l’échantillon à 2000 G pendant cinq minutes à température ambiante pour séparer le sérum du caillot. Après avoir centrifugé à nouveau l’échantillon, prélever soigneusement la couche supérieure claire du sérum sans perturber le caillot.

Conservez le sérum à 20 degrés Celsius, jusqu’à ce qu’il soit prêt pour l’analyse des cytokines en aval. Après l’injection, peser les barrages quotidiennement pendant trois jours pour surveiller la réponse à l’acide poly-IC. Le jour de la parturation prévue, notez les résultats de la portée incluant la taille de la portée, la viabilité du chiot ou l’absence de portée pour indiquer une grossesse infructueuse.

Retirez rapidement tout chiot décédé et jetez-en conformément aux directives de biosécurité institutionnelle. Utilisez des tests ELISA ou multiplex pour quantifier les cytokines inflammatoires telles que l’IL-6 et le TNF-alpha dans le sérum maternel après une injection d’exaustion par injection ou des injections témoins selon les instructions du fabricant. Après la quantification, utilisez les résultats pour établir un seuil représentatif de la réponse MIA.

Enfin, effectuez une analyse statistique à l’aide de notre logiciel pour évaluer la relation entre les niveaux d’IL-6 sérique maternel et de TNF alpha. Après l’administration du poly IC au jour embryonnaire 9,5, les barrages MIA ont montré des niveaux d’IL-6 significativement accrus par rapport aux barrages témoins. Les niveaux de TNF alpha ont montré une forte corrélation positive avec les niveaux maternels d’IL-6.

Entre le jour embryonnaire 0,5 et le jour embryonnaire 9,5, les mères ayant réussi à mettre au monde ont pris beaucoup plus de poids que celles qui n’ont pas réussi à produire une portée. Un jour après l’injection, les barrages MIA ont perdu du poids, tandis que les barrages témoins traités au sérum ont pris du poids. Mais au 12e jour embryonnaire, les deux groupes ont montré une prise de poids similaire.

Le poids avant la grossesse n’a pas affecté l’efficacité de la portée ni chez les dames témoins traitées au sérum ni chez les dames MIA. Cependant, les souris C57 BL6 provenant des laboratoires Jackson ont eu des portées plus réussies que les souris C57 BL6 provenant de Charles River lors de la procédure MIA. En revanche, la source de la poly IC n’a pas affecté l’efficacité des portées.

De plus, les animaux issus de Jackson Labs présentaient une réponse inflammatoire maternelle plus robuste, mesurée par le sérum IL-6, comparé aux animaux issus de Charles River. En revanche, la réponse inflammatoire maternelle était la même selon les différentes sources de poly IC. Le protocole permet la génération reproductible du modèle précoce d’AIM et la corrélation de la sévérité de l’inflammation maternelle avec les résultats expérimentaux de la descendance. Il est essentiel de tenir des registres détaillés, de suivre le nombre de lots de réactifs et d’évaluer les réponses des cytokines maternelles dans tous les barrages afin d’assurer des résultats reproductibles.