Cartographie de la morphologie des cellules étoilées hépatiques dans des modèles murins de fibrose hépatique

Ce protocole présente un pipeline d’imagerie complet pour visualiser et modéliser la morphologie des cellules étoilées hépatiques dans le tissu hépatique intact. L’imagerie 2D actuelle manque de morphologie complète des cellules stellaires, limitant les connaissances structurelles et fonctionnelles. Ce protocole permet des captures robustes d’architectures 3D complexes.

Pour commencer, pincez les paumes d’une souris anesthésiée pour assurer une anesthésie adéquate. Vaporisez l’abdomen avec 70 % d’éthanol pour humidifier la fourrure. Avec une pince, soulevez la peau au milieu de l’abdomen alignée avec les pattes arrière et commencez à couper la peau pour révéler l’abdomen.

Ensuite, utilisez des cotons-tiges humidifiés avec du PBS pour déplacer les intestins et autres organes sur le côté et soulever le lobe gauche. Coupez soigneusement la membrane attachée entre le lobe gauche et le lobe caudé. Ensuite, utilisez une suture pour attacher à la base supérieure du lobe gauche.

Coupez le lobe gauche sous le nœud de suture et mettez-le de côté pour la collecte et le traitement des échantillons de tissu. Utilisez des cotons-tiges humidifiés au PBS pour déplacer le foie et révéler la veine porte. Ensuite, insérez délicatement l’aiguille du cathéter dans la veine porte à mi-parcours de sa longueur.

Retirez l’aiguille du cathéter. Assurez-vous d’un flux sanguin reflux à travers le cathéter pour indiquer une insertion réussie. Reliez le tube rempli de la pompe à perfusion en fonctionnement au cathéter et perfusez le foie avec 20 millilitres de PBS.

Clampez l’artère pulmonaire au-dessus du foie avec un hémostat pour empêcher le PBS de traverser le cœur. Coupez la veine cave inférieure pour libérer l’accumulation de pression. Ajustez la vitesse de la pompe à cinq millilitres par minute.

Après 15 minutes, arrêtez la pompe pour changer le réservoir à 4 % de paraformodéhyde puis perfonez le foie avec 25 millilitres de paraformodéhyde à 4 %. Une fois la perfusion terminée, retirer le foie des organes environnants en coupant les tissus connexeurs. Placez le foie dans un tube conique de 50 millilitres rempli de 25 millilitres de paraformoldéhyde à 4 %.

Placez le tube horizontalement sur une plateforme de balancement pendant la nuit dans une chambre froide à quatre degrés Celsius à 1,5 tour par minute. Le lendemain, lavez le foie trois fois en PBS sur une plateforme de bascule banc pendant 30 minutes chacune à température ambiante à 1,5 tour par minute. Transférez le foie à 20 millilitres de PBS avec 0,02 % d’azide de sodium et conservez à quatre degrés Celsius.

Découpez les échantillons de foie en morceaux d’environ 0,5 à 1 centimètre cube. Transférez les échantillons de foie dans des fioles en verre avec des bouchons à vis. Déshydrater les échantillons dans une série de méthanol dilué à l’eau de 20 % à 80 % sur un rotateur de roue à huit rotations par minute pendant une heure chacun à température ambiante.

Après avoir effectué le blanchiment, la perméabilisation, l’immunomarquage et le débarrassage, incubez l’échantillon dans l’éther dibenzylique toute la nuit à température ambiante avant l’imagerie. Les échantillons peuvent être stockés dans l’éther dibenzylique pendant jusqu’à un an sans perte du signal de coloration. Pour l’imagerie confocale, placez l’échantillon dégagé dans un plat à fond en verre de 35 millimètres avec un fond en verre de nombre 1,5.

Remplissez le plat d’éthyle cinnamate pour submerger complètement l’échantillon. Ensuite, placez la plaque sur la scène du microscope confocal. Acquérir une image de tuile sur le plan le plus lumineux pour capturer une grande surface de l’échantillon en utilisant le format 1024 par 1024 et une vitesse de 600.

À partir de l’image en tuile, sélectionnez les régions d’intérêt pour collecter un Z-scan à plus haute résolution. Ensuite, acquérez une pile Z couvrant toute la profondeur du tissu dégagé à la résolution la plus élevée supportée par le microscope en utilisant un format 1024 par 1024 et une vitesse de balayage de 600. Une perfusion et une fixation réussies du foie de souris ont donné une couleur uniforme de couleur beige beige.

Une perfusion inadéquate entraînait des caillots sanguins rouge foncé ou brun, ce qui réduisait la clarté optique et entraînait un signal de fond élevé dans ces régions. Une transparence optique complète a été obtenue après incubation dans l’éther dibenzylique, où le tissu paraissait clair comparé à avant la clairvoyance. Les Z-stacks à haute résolution ont révélé de fins processus dendritiques s’étendant à partir du corps cellulaire des cellules stellées hépatiques individuelles.

Des échantillons tétrochlorure de carbone tétrachlorure de tétrachlorure ont montré des signaux fluorescents forts et stables sous microscopie confocale. Ce pipeline cartographie de manière reproductible la morphologie des cellules étoilées dans le serveur complexe du microenvironnement, capturant les processus dendritiques et les relations spatiales avec les cellules voisines. L’engagement en temps est un facteur important à considérer lors de l’exécution du protocole.

Le processus de compensation dure environ trois semaines, ce qui nécessite une planification préalable. Permettant une analyse morphométrique 3D précise, cette plateforme relie la structure des fibroblastes à des fonctions, faisant progresser les connaissances sur l’homéostasie tissulaire et un mécanisme Z.