Isolement et purification des îlots pancréatiques à partir de rats de Lewis grâce à la digestion enzymatique et à la séparation par gradient de densité

Nos recherches portent sur le développement d’un protocole standardisé d’isolation d’œillets Lewis Rat à haut débit afin d’optimiser le rendement, la pureté, la viabilité et la longévité fonctionnelle. Les méthodes existantes produisent des œillets variables impurs et à courte durée de vie. Ce protocole standardise la digestion, la purification et le pooling afin d’améliorer la cohérence et la longévité.

Pour commencer, mettez un rat euthanasié sous un microscope. À l’aide de ciseaux cutanés, réalisez une incision en V en partant de la synthèse pubienne vers chaque cage thoracique latérale pour accéder à la cavité abdominale. À l’aide de pinces plates, rétractez les intestins grêles et gros du côté gauche de l’animal pour libérer l’espace de travail de la cavité abdominale.

Ensuite, utilisez la pince plate et les hémostaux courbés pour déployer le duodénum supérieur. Assurez-vous que le canal biliaire commun et la veine porte hépatique sont dans le champ de vision. Utilisez maintenant les hémostrates courbés pour rétracter le foie dans la direction du céphalon.

Clampez le canal biliaire commun et la veine hépatique à un à deux millimètres du foie. Sous la vue du microscope, avec des pinces plates et des hémostaux plats, mobiliser doucement le contenu du duodénum pour dégager le sphincter de l’audi. Puis pincez doucement le duodénum à environ cinq millimètres de chaque côté du sphincter de l’audi pour isoler la région environnante.

Assurez-vous d’une compression minimale pour préserver l’intégrité des tissus. Insérez soigneusement l’aiguille d’une seringue contenant du WDM stérile à travers la paroi duodénale. Faites passer l’aiguille à travers le corps du sphincter et faites-la avancer dans le canal pancréatique principal pour la perfusion.

Tout en maintenant une pression constante, perfusez sept à dix millilitres de WDM dans le pancréas à un rythme d’environ 500 microlitres par seconde jusqu’à ce que le pancréas soit complètement distendu. Maintenant, retirez les deux hématosats plats du duodénum. Ensuite, disséquez doucement et libérez le pancréas des structures environnantes en commençant par la rate, l’estomac, le gros intestin, le duodénum et le mésentar.

Soulevez doucement le pancréas perfusé avec une pince plate et utilisez des ciseaux fins à disséquer pour sectionner les dernières attaches du tissu conjonctif. Transférez immédiatement le pancréas excisé dans une boîte de Petri contenant une solution de rinçage glacée et procédez à la récolte du pancréas suivant pendant que le pancréas excisé est en cours de nettoyage. Pour nettoyer le pancréas, utilisez une paire de pinces fines courbées et des ciseaux de dissection fine afin d’enlever soigneusement les ganglions lymphatiques, le tissu adipeux, le présent et les grands vasculaires du pancréas perfusé.

Transférez le pancréas nettoyé dans un bécher stérile de 600 millilitres contenant 25 millilitres de WDM froid. Couvrez le bécher avec du papier aluminium stérile pour maintenir la propreté lors du transfert de l’atelier chirurgical à celui de culture cellulaire. Transférez le bécher dans un bain-marie à shaker orbital réglé à 130 tours par minute pendant 10 minutes.

À la cinquième minute, faites tourner manuellement le bécher dans le sens des aiguilles d’une montre puis antihoraire pour faciliter la dissociation des tissus. À la 10e minute, transférez rapidement le bécher et immergez-le dans la glace pour ralentir l’activité enzymatique. Ensuite, ajoutez un volume égal de tampon de trempe à la solution dans le bécher pour arrêter la digestion.

À l’aide d’une seringue de 50 millilitres équipée d’une aiguille spinale calibre 14, aspirez doucement et expulsez la suspension tissulaire à plusieurs reprises pour dissocier de gros fragments tissulaires. Transférez la suspension dans des tubes coniques de 200 millilitres. Après centrifugation de la suspension, découlez soigneusement le surnageant et resuspendez la pastille dans 100 millilitres de substrat de lavage.

Filtrez maintenant la suspension à travers un tamis stérile de 500 micromètres placé sur un bécher stérile de 600 millilitres pour retirer de gros tissus non digérés. Transférez le filtrat dans de nouveaux tubes coniques de 200 millilitres avant de centrifuger à nouveau. Pour la purification des œillets, utilisez une pipette sérologique pré-mariée de 10 millilitres pour resuspendre chaque granule tissulaire dans 15 millilitres de solution en gradient pour deux millilitres de volume de pellets.

Mélangez doucement jusqu’à ce que la suspension soit uniforme. Distribuez soigneusement 15 millilitres de la suspension à cellules au fond de chaque tube conique de 50 millilitres en évitant le contact avec les parois du tube afin d’assurer des gradients propres. Ensuite, utilisez une pompe à seringue pour distribuer 10 millilitres de chaque gradient à un rythme de cinq millilitres par minute tout en positionnant la pointe de l’aiguille de calibre 16 contre la paroi interne du tube pour éviter le mélange.

Après centrifugation des tubes, identifiez la couche d’œillets située aux interfaces entre les couches de gradient. À l’aide d’une pipette à fil de joint, collectez la couche d’œillets, puis transférez les œillets collectés dans un tube conique prérefroidi de 200 millilitres contenant cinq millilitres de substrat de lavage. Augmentez le volume à 200 millilitres avec un produit de lavage et effectuez les étapes suivantes de lavage et de centrifugation.

Ensuite, placez uniformément les œillets dans des boîtes de Pétri de 100 millimètres traitées sans culture tissulaire, en utilisant une plaque pour chaque pancréas de cinq traités. Lors de l’isolation testée, le rendement était de 3 330 équivalents d’œillets par pancréas avec un diamètre médian d’œillets dans la boîte de 50 à 100 micromètres. Le dimensionnement automatisé a permis de recueillir 98 832 objets au total, ce qui est fortement corrélé aux équivalents manuels des paupières mesurés au jour zéro.

La pureté endocrinienne était d’environ 98,56 % basée sur la coloration dithozone au premier jour. Les indices de stimulation étaient de 9,37 au premier jour, 8,34 au troisième jour et 6,7 au septième jour, sans différences significatives entre les points temporels. Cette méthode permet d’étudier la transplantation d’œillets, la fonction des cellules bêta, la réversion du diabète, l’encapsulation des œillets et les interactions immunitaires ou micro-environnementales des œillets.

Ce protocole peut être applicable à la transplantation préclinique, à la modélisation du diabète, aux études d’encapsulation et aux essais fonctionnels in vitro nécessitant des œillets Lewis Rat de haute pureté.