Protocole pour la dissociation unicellulaire, le séquençage de l’ARN et l’isolement des cellules myoépithéliales et des fibroblastes des glandes lacrymales et salivaires âgées

Mon laboratoire étudie comment les changements liés à l’âge dans les glandes salivaires et lacrymales affectent différents types cellulaires grâce à la cytométrie en flux et au séquençage à ARN unicellulaire. Les méthodes de dissociation standard récupèrent mal les cellules épithéliales fragiles des glandes salivaires et lacrymales vieillies. Et mon protocole améliore la viabilité des cellules et permet une analyse et un tri fiables sur une seule cellule.

Pour commencer, placez la souris euthanasiée allongée sur la table de dissection. À l’aide de pinces fines et de ciseaux, incisez la peau entre l’œil et l’oreille. Rétractez doucement la peau pour exposer la glande lacrymale.

À l’aide de pinces à bout émoussé, soulevez légèrement la glande lacrymale. Séparez soigneusement le tissu conjonctif environnant en le détachant doucement en cercle. Identifiez les limites visibles de la glande lacrymale et séparez-la des tissus adjacents, y compris la glande parotide.

Ensuite, transférez la glande lacrymale dans une boîte de Petri de 35 millimètres contenant deux millilitres de PBS froid sur glace. Au microscope disséqueur, retirez la graisse restante et retirez soigneusement la capsule de tissu conjonctif de la glande lacrymale. Posez une boîte de Petri stérile de 35 millimètres sur la glace.

Ajoutez 800 à 1000 microlitres de PBS froid au centre de la plaque et transférez une glande lacrymale dans le PBS. Assurez-vous que le tissu reste immergé dans le PBS. À l’aide de deux scalpels stériles, hachez finement la glande lacrymale en petits fragments jusqu’à obtenir une consistance tendre et pâteuse.

Rassemblez les fragments de tissu sur un côté de la plaque. Aspirez le PBS résiduel et lavez les fragments avec un millilitre de PBS frais et froid. Transférez les fragments de tissu lavés dans une plaque à 12 puits contenant deux millilitres par puits de milieu digestif préchauffé.

Placez la plaque dans un bain-marie secouant et incubez à 37 degrés Celsius et 60 tours par minute pendant 30 minutes. À l’aide d’une pointe de pipette large calibre d’un millilitre, triturez doucement le tissu 15 fois. Remettez l’assiette dans le bain-marie et faites couver pendant 30 minutes supplémentaires.

Ensuite, à l’aide d’une pointe de pipette classique d’un millilitre, triturez doucement l’échantillon 10 fois puis étouffez à nouveau pendant 30 minutes. Ensuite, triturez doucement l’échantillon 10 fois et transférez la suspension cellulaire dans des tubes microcentrifugeuses dauphins de deux millilitres. Ajoutez un millilitre de milieu anti-froid 1, ou BM1, dans chaque puits de la plaque pour collecter le milieu digestif restant contenant des cellules résiduelles, puis placez la plaque sur la glace jusqu’à l’étape suivante.

Centrifugez les tubes contenant la suspension de la cellule à 300 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Jetez le surnageant de chaque tube. Transférez le BM1 de chaque puits de la plaque contenant les cellules résiduelles dans le tube correspondant.

Ensuite, ajoutez 600 microlitres de BM1 froid dans chaque puits pour rincer les cellules restantes et transférez le lavage dans le tube correspondant pour le combiner avec la suspension des cellules. Suspendez doucement la suspension de la cellule. Centrifugez à nouveau les tubes à 300 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius et jetez le surnageant.

Ajoutez un millilitre d’Accutase aux granulés cellulaires et resuspendez doucement les cellules. Incubez le tube à 37 degrés Celsius et 60 tours par minute pendant cinq à dix minutes. À l’aide d’une pointe de pipette d’un millilitre, triturez doucement l’échantillon 10 fois.

Ensuite, ajoutez un millilitre de BM2 froid dans le tube pour interrompre la réaction enzymatique en diluant l’Accutase. Centrifugez le tube à 300 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius et jetez le surnageant. Ajoutez un milieu contenant DNase 1 à une concentration de 200 unités par millilitre dans le tube pour resuspendre les cellules et remplir le tube jusqu’au sommet.

Couver le tube pendant 10 minutes à température ambiante, puis resuspendre doucement une fois après cinq minutes. Pendant ce temps, placez une passoire à cellules de 70 micromètres sur un tube conique de 15 millilitres, et préhumidifiez la passoire avec un millilitre de BM3. Après l’incubation, transférez la suspension cellulaire sur la passoire.

Ajoutez un millilitre de BM3 dans le tube de collecte d’origine pour le rincer et transférez le rinçage sur la même passoire. Lavez la passoire avec cinq millilitres supplémentaires de BM3. Enfin, déterminer la concentration cellulaire et la viabilité de la suspension cellulaire filtrée à l’aide d’une coloration au bleu de trypan et d’un compteur cellulaire automatisé.

Poursuivez avec des applications en aval, telles que le séquençage d’ARN unicellulaire pour le profilage de l’expression génique, ou le tri cellulaire basé sur la cytométrie de flux des populations cellulaires marquées fluorescentement. L’analyse UMAP des données de séquençage d’ARN unicellulaire a identifié des populations épithéliales et stromales bien représentées dans la glande lacrymale, y compris les cellules myoépithéliales et les fibroblastes, ainsi que des populations immunitaires diverses et diverses. Les glandes lacrymales vieillies contenaient un plasma abondant et activaient des cellules B exprimant IGHM et IGHD.

Le gate de cytométrie en flux séquentiel a permis une séparation claire des cellules myoépithéliales positives à EpCAM et GFP à celles murales négatives à EpCAM et positives à GFP. Les fibroblastes positifs à GFP exprimant PDGFR alpha étaient négatifs à EpCAM, permettant la discrimination des cellules épithéliales. Chez les souris PDGFR alpha et EGFP, toutes les cellules GFP-positives ont également exprimé du collagène un, confirmant l’identité des fibroblastes.

L’analyse par cytométrie en flux a montré que 99,6 % des cellules GFP-positives correspondaient à des cellules immuno-colorées par PDGFR alpha. Ce protocole vise à isoler des cellules uniques viables provenant des glandes lacrymales pour la caractérisation moléculaire des populations épithéliales, stromales et immunitaires. Le principal défi est de minimiser le stress mécanique et enzymatique lors de la dissociation de tissus fragiles vieillis, tout en maintenant une forte viabilité cellulaire pour le séquençage de l’ARN unicellulaire.

Suite à cette procédure, les cellules isolées peuvent être utilisées pour le séquençage d’ARN unicellulaire, le séquençage d’ARN en vrac et le profilage moléculaire de populations cellulaires spécifiques. Les cellules triées peuvent également être cultivées pour des tests fonctionnels en aval.