Synthèse, encapsulation de l’hémoglobine et PEGylation biorthogonale dans des nanoparticules hiérarchiquement poreuses d’UiO-66 pour applications d’apport d’oxygène

L’objectif de cette recherche est de définir une structure métal-organique stable, une nanoparticule basée sur le MOF pour l’encapsulation de l’hémoglobine et la délivrance d’oxygène. Le morph poreux hiérarch peut surmonter la limitation de taille du poste pour l’encapsulation de l’hémoglobine, et la population de surface peut améliorer la stabilité des particules dans les environnements physiologiques. Pour commencer, peser avec précision 50 milligrammes de nanoparticules d’UIO 66 hiérarchiquement poreuses préparées dans une fiole ronde de 25 millilitres.

Ajoutez 10 millilitres de tétrahydrofurane à la fiole. Ensuite, on ultrasonifie le mélange pendant cinq minutes pour disperser complètement les particules, produisant ainsi une suspension opaque uniforme. Placez la fiole à fond rond dans un bain d’eau glacée sur un agitateur magnétique réglé à 400 tr/min.

À l’aide d’une seringue en verre, ajoutez 0,4 millilitre de nitrite de tert butyle goutte par goutte sur cinq minutes tout en maintenant la température en dessous de cinq degrés Celsius. Ajoutez immédiatement 0,35 millilitre de triméthyl SL azide goutte par goutte dans les mêmes conditions froides. Une légère effervescence peut apparaître, indiquant une progression de la nitrosation.

Ensuite, enveloppez le bain d’eau glacée dans du papier aluminium pour protéger la réaction de la lumière. Continuez à remuer le mélange de réaction dans le bain d’eau glacée toute la nuit. Le lendemain, lavez et séchez le produit comme indiqué.

Ensuite, utilisez la spectroscopie FTIR pour vérifier la transformation chimique. Transférer cinq milligrammes de nanoparticules d’azide UIO 66, hiérarchiquement poreuses, dans un tube centrifugeuse de deux millilitres. Ajoutez 0,5 millilitre de tampon HEPES et sonez pendant deux à cinq minutes.

Ajoutez 0,5 millilitre de tampon HEPES contenant 20 milligrammes par millilitre d’hémoglobine, et inversez doucement le tube plusieurs fois pour disperser complètement les nanoparticules. Placez maintenant le tube sur un vibrateur thermique et évacuez à température ambiante en secouant à 1 000 tr/min pendant deux heures. Après l’incubation, centrifugez le tube à 13 500 G pendant cinq minutes à température ambiante, pour pelleter les nanoparticules d’azide UIO 66, chargées d’hémoglobine et poreuses de façon hiérarchique.

Ensuite, il collecte soigneusement le surnageant pour quantifier l’hémoglobine non piégée. Lavez doucement le granule trois fois avec un millilitre d’eau ultrapure en pipotant de haut en bas pour éliminer l’hémoglobine faiblement absorbée. Ensuite, il faut soigneusement recueillir le surnageant de chaque lavage pour quantifier l’hémoglobine emprisonnée.

Resuspendez la dernière pastille dans 0,5 millilitre d’eau ultrapure et conservez-la au réfrigérateur avant la caractérisation. Utilisez le test d’hémoglobine sulfate de laurier sodique pour déterminer l’hémoglobine piégée dans les surnatants collectés. Pipeter 10 microlitres de chaque surnageant dans une microplaque de 96 puits.

Ajoutez 100 microlitres de réactif sulfate de laurier de sodium et faites éclore pendant cinq minutes à température ambiante dans le noir. À l’aide d’un spectrophotomètre ultraviolet visible, mesurez l’absorbance à 412 nanomètres. Ensuite, préparez une dilution sériculée du stock d’hémoglobine dans le tampon HEPES pour générer une courbe standard.

Transférez les dilutions préparées dans la plaque de 96 puits préparée pour générer une courbe standard permettant de convertir les lectures d’absorption en concentrations d’hémoglobine. Transférer 10 milligrammes des nanoparticules d’azide UIO 66 chargées en hémoglobine dans un tube centrifuge de deux millilitres, contenant 0,5 millilitre d’eau ultrapure, et sonicer pendant deux à cinq minutes. Ajoutez 20 milligrammes de dibenzocyclooctane, modifié avec du polyéthylène glycol pour obtenir un rapport équimolaire entre le polyéthylène glycol et les nanoparticules.

Faites doucement tourner le tube jusqu’à homogénéiser le mélange. Placez le tube sur un vibrateur thermique et étouffez à température ambiante, en secouant à 1 000 tr/min pendant une heure. Ensuite, transférez le tube dans un réfrigérateur maintenu à quatre degrés Celsius pour une réaction nocturne.

Centrifugez le tube à 12 000 G pendant cinq minutes à température ambiante pour pelleter les nanoparticules UIO 66 modifiées en polyéthylène glycol, chargées en hémoglobine, hiérarchiquement poreuses. Puis jetez le surnageant, contenant du polyéthylène glycol non réactif. Lavez la pellete trois fois avec de l’eau ultrapure de deux millilitres en pipettant vers le haut et vers le bas et en centrifugant dans les mêmes conditions que celles montrées précédemment.

Résuspendez les nanoparticules de polyéthylène glycol UIO 66, chargées en hémoglobine pégylée purifiées, hiérarchiquement poreuses, dans deux millilitres d’eau ultrapure. Stockez la suspension à quatre degrés Celsius. Le colloïde résultant apparaît homogène et légèrement opalescent, indiquant une bonne stabilité de dispersion.

Puis confirmez la réussite de la pegylation par diffusion dynamique de la lumière, ou DLS. Les groupes aminés de surface ont été convertis avec succès en azides. Cela a été démontré par l’apparition d’une bande d’azide asymétrique caractéristique, étirant à 2 122 centimètres inverses dans le spectre FTIR des nanoparticules d’azide UIO 66 hiérarchiquement poreuses.

Cette bande était absente dans les nanoparticules d’amine UIO 66 hiérarchiquement poreuses. L’encapsulation de l’hémoglobine était visiblement indiquée par un changement de couleur distinct du jaune au rouge. L’absorption de l’azote a diminué après la charge d’hémoglobine, indiquant l’occupation des mésopores par des molécules d’hémoglobine.

Le potentiel zêta des nanoparticules d’azide UIO 66, hiérarchiquement poreuses, est passé de 42,9 millivolts à 20,4 millivolts après l’encapsulation de l’hémoglobine. La conjugaison réussie du polyéthylène glycol a été confirmée par la disparition des acides qui s’étirent en vibration à 2 122 centimètres inverses, et par l’apparition de signaux associés au polyéthylène glycol dans le spectre FTIR. L’analyse DLS a montré une augmentation du diamètre hydrodynamique d’environ 114,9 à 140,8 nanomètres après la pégylation, tout en maintenant un PDI faible.

Cette particule permet la synthèse de nanoparticules morph hiérarchiquement poreuses, l’encapsulation de l’hémoglobine, la peculation de surface et l’évaluation de la fonctionnalité de libération d’oxygène. Grâce à ce protocole, une caractérisation physique chimique supplémentaire et une étude fonctionnelle peuvent être menées, incluant l’analyse de la libération d’oxygène in vitro et de la biocompatibilité des nanoparticules. De futures études pourront se concentrer sur la préservation de la fonctionnalité de l’hémoglobine pour des raisons plus longues, comme l’incorporation de composants pour prévenir une dégradation substantielle.