Isolation efficace des cellules souches et adipocytes dérivés de l’adipeux à partir du tissu adipeux porcine

Le but de cette recherche est d’isoler efficacement et rapidement les cellules du tissu adipeux. La digestion traditionnelle est un coût en temps et peut être surdigérée. Notre mesure enzymatique et mécanique d’onde offre une dispersion douce et réduit le temps d’isolement.

Pour commencer, mettez un morceau de tissu adipeux sous-cutané dorsal d’un porc euthanasié dans une boîte de culture. Séquez le long du plan naturel entre le tissu adipeux et le derme pour obtenir une feuille ULB complète de deux à trois millimètres d’épaisseur. Rincez l’ULB une fois dans une solution saline stérile glacée.

Après avoir déchiré une boîte de culture stérile, pèsez le tissu dans la boîte stérile sur une balance pré-stérilisée. Pour chaque 1,8 gramme de tissu, ajoutez 10 millilitres de tampon de D-Hank glacé, et maintenez le tissu complètement immergé. Utilisez des ciseaux chirurgicaux stériles pour identifier et exciser tous les vaisseaux sanguins visibles du tissu.

Retirez tout tissu conjonctif et composants fibrotiques. Jetez les matériaux excisés dans des récipients désignés comme biohazard. Rincez les tissus dans le tampon de D-Hank pour éliminer les résidus de sang et les débris.

Pèser le tissu dans la boîte de culture stérile sur une balance pré-stérilisée après avoir déchiré la plaque. Transférez 1,8 gramme des fragments de tissu de rinçage dans un tube microcentrifuge stérile de 1,5 millilitre. Ajoutez 800 microlitres de tampon de dissociation tissulaire de type A au tube.

Utilisez des ciseaux ophtalmiques stériles pour hacher le tissu du tube en morceaux d’environ un à deux millimètres cubes. Transférez le tissu haché ainsi que le tampon environnant dans un nouveau tube de microcentrifugeuse. Ajoutez 200 microlitres d’agent dissociateur tissulaire de type A dans le tube.

Faites pivoter et secouer doucement le tube à la main trois fois pour mélanger le contenu. Assurez-vous que les fragments adipos sont complètement immergés dans la solution de dissociation. Vérifie si le bouchon du tube est bien fermé.

Placez le tube dans un bain métallique à 37 degrés Celsius et incubez pendant cinq à dix minutes. Transférez le tissu adipeux partiellement digéré dans un tampon dans un tube microcentrifuge stérile de 1,5 millilitre désigné pour le système de dissociation mécanique. Exécutez le programme prédéfini pour le tissu adipeux afin d’effectuer une dissociation mécanique à l’aide d’une onde sinusoïdale de 200 hertz.

Récupérez la suspension de cellules et faites-la passer à travers une tamoire de cellules de 200 micromètres jusqu’à un nouveau tube centrifugeuse de 50 millilitres. Ajoutez cinq millilitres de solution D-Hank pré-refroidie à quatre degrés Celsius sur la passoire. Rincez la passoire deux fois avec la solution D-Hank.

Centrifugez la suspension à cellules filtrées à 500 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Utilisez une pipette pasteur stérile pour aspirer et éliminer la couche lipidique surnageante tout en laissant un millilitre de tampon pour protéger la couche d’adipocytes. Collectez la deuxième couche contenant les adipocytes sans perturber la troisième et la quatrième couche.

Aspirez et jetez la troisième couche. Ajoutez un millilitre de tampon de D.Hank à la granule inférieure contenant la fraction vasculaire stromale ou SVF. Resuspendez doucement la pastille cellulaire dans le tampon pour atteindre une concentration cellulaire de deux à cinq fois dix à la puissance de six cellules par millilitre.

Préparez la suspension à cellules SVF dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre. Gardez la suspension sur la glace jusqu’à utilisation. Ajoutez 10 microlitres de suspension à cellules SVF et 10 microlitres de solution bleue de trypan à 0,4 % dans un tube centrifugeuse microcentrifuge stérile de 0,5 millilitre.

Pippette doucement trois fois de haut en bas. Transférez 10 microlitres du mélange de cellules colorées sur une lame de comptage, adaptée au compteur cellulaire automatisé. Vérifiez que l’échantillon remplit complètement la chambre sans déborder.

Insérez la glissière de comptage dans le compteur automatique de cellules. Sélectionnez le type de test bleu de trypan et ajustez la plage de concentration cellulaire si nécessaire. Appuyez sur le comptage pour lancer le comptage automatisé des cellules.

Surveillez les images de la chambre de comptage et observez la distinction automatique entre cellules vivantes et mortes. Notez le pourcentage de viabilité des cellules et le nombre total de cellules viables affichées sur l’écran de l’instrument. Effectuez trois mesures indépendantes pour chaque échantillon.

Calculez la viabilité moyenne et le rendement cellulaire par gramme de tissu adipeux. Préparez une solution colorante avec cinq microgrammes par millilitre écorché et un micromolaire BODIPY chez D.Hank’s. Incubez les adipocytes isolés dans la solution colorante pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius.

Utilisez un système de verre de couvercle de lames adapté aux adipocytes pour les préparations adaptées à la microscopie à fluorescence. Le système de montage adapté aux adipocytes maison permettait une distribution uniforme des adipocytes intacts pour une imagerie claire. Contrairement aux méthodes traditionnelles qui produisaient des agencements surchargés et en plusieurs couches, les adipocytes extraits présentaient une structure intacte et une morphologie normale.

Le taux de survie des adipocytes obtenu par la méthode de dissociation mécanique était significativement plus élevé que la méthode traditionnelle d’hydrolyse enzymatique. Les cellules souches dérivées de l’adipe purifiées et cultivées présentaient une morphologie uniforme semblable à celle d’un fibroblaste, avec des cellules allongées en forme de fuseau disposées de manière ordonnée. La plupart des cellules restaient non colorées, indiquant leur viabilité, tandis qu’une petite proportion seule était colorée en bleu, représentant des cellules mortes.

Ce protocole permet aux chercheurs de comparer les caractères cellulaires isolés à travers les dépôts d’adipeux. Les SVF isolés du protocole peuvent être utilisés pour la construction d’organoïdes et la purification des cellules souches adiposes. Des études futures pourraient optimiser davantage la méthode d’isolement, en tenant compte des variations du tissu adipeux dans la matrice extracellulaire à travers le dépôt.