Name: Évaluation de sphéroïdes 3D pour des études de transduction par AAV (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-08-14T13:25:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: Découvrez une plateforme de sphéroïdes 3D pour évaluer la puissance des vecteurs AAV et la cinétique d'expression transgénique. Cette méthode permet une analyse quantitative en temps réel de la transduction et optimise le développement de thérapies géniques.

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Les auteurs remercient Morten Seirup et Trish Hoang pour avoir fourni le plasmide destiné à la production de nanoluciférase AAV ainsi que les réactifs substrat vivants. Ce projet a bénéficié du soutien d'un poste dans le programme de participation à la recherche ORISE au CBER, U.S. Food and Drug Administration, géré par l'Institut Oak Ridge pour les sciences et l'éducation dans le cadre d'un accord interagences entre le ministère américain de l'Énergie et la FDA.

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Les auteurs n'ont rien à divulguer.

Nous présentons ici une plateforme 3D in vitro&#160; simplifiée pour le développement et le test de l'efficacité des AAV. Cette plateforme exploite une transduction améliorée, une haute sensibilité et une meilleure prévisibilité translationnelle grâce à une culture cellulaire tridimensionnelle qui reproduit plus fidèlement l'architecture des tissus humains. Ce système parvient à distinguer avec succès l'efficacité de transduction entre différents sérotypes d'AAV et différents éléments régulateurs, y compris les vecteurs simples brins et auto-complémentaires, dans plusieurs lignées cellulaires. Nous notons que, contrairement aux essais conventionnels en 2D, où l'efficacité de transduction est souvent définie comme le pourcentage de cellules positives pour le transgène, le système de sphéroïdes en 3D ne permet pas facilement une quantification à la résolution monocellulaire. Par conséquent, l'efficacité de transduction dans cette étude est définie comme l'intensité globale du signal rapporteur (fluorescent ou luminescent), reflétant la contribution combinée de la proportion de cellules transduites et du niveau d'expression du transgène par cellule. La grande sensibilité des sphéroïdes réduit considérablement le besoin de grandes quantités de produit, ce qui rend la méthode rentable, polyvalente et physiologiquement pertinente pour la recherche et le développement d'AAV.
Cette approche répond aux principaux défis posés par les essais classiques de culture cellulaire en 2D, qui reposent sur l'adhésion à des surfaces artificielles et manquent d'organisation cellulaire, ce qui pourrait&#160;entraîner de mauvaises prévisions du rendement des vecteurs dans des contextes cliniques. Le système de sphéroïdes en 3D imite mieux la structure tissulaire et les profils de distribution des médicaments, fournissant des données sur le comportement des vecteurs qui correspondent plus étroitement aux conditions biologiques réelles22,23. Le protocole utilise des plaques simples à adhérence ultra-faible, ce qui le rend facilement reproductible dans des conditions de laboratoire standard.
Ce système adaptable pourrait être utilisé pour des dosages de neutralisation des AAV, pour étudier la pénétration des AAV, et pour développer des expériences de co-culture plus complexes afin d'analyser les effets de différents environnements cellulaires sur la transduction par les AAV. De plus, des plates-formes de criblage à haut débit de médicaments et de vecteurs peuvent facilement être intégrées à la plateforme de sphéroïdes, permettant l'automatisation et la réduction des coûts dans les flux de travail de découverte de vecteurs pour le développement de produits plus ciblés.
Un avantage pratique majeur des sphéroïdes est leur capacité à croître de manière continue pendant des semaines sans passage cellulaire, permettant des études prolongées de l'activité des AAV. Ce système de culture stable préserve d'importantes interactions entre cellules et des composants de la matrice, évitant les interruptions dues aux prélèvements cellulaires répétés nécessaires dans les cultures en 2D24. L'environnement cellulaire préservé soutient une organisation naturelle des protéines et des structures membranaires essentielles à l'évaluation de la liaison et de l'entrée des AAV dans les cellules25.
Bien que les sphéroïdes tridimensionnels présentent un grand potentiel pour l'évaluation de la transduction par les AAV, ils présentent également certaines limites translationnelles par rapport aux modèles in vivo&#160;, principalement en raison de leur structure simplifiée par rapport aux tissus natifs. Les sphéroïdes manquent de composants physiologiques essentiels, notamment une vascularisation pour la délivrance du vecteur, des cellules immunitaires permettant d'évaluer l'immunogénicité, et des barrières tissulaires spécifiques telles que la barrière hémato-encéphalique, qui pourraient avoir un impact significatif sur les performances des AAV26. Ces limitations indiquent que, malgré leur niveau de complexité intermédiaire entre les cultures conventionnelles en 2D et les modèles animaux in vivo, les sphéroïdes restent insuffisants pour recréer complètement le microenvironnement physiologique nécessaire à une évaluation exhaustive des AAV.
Le protocole de sphéroïdes présenté ici décrit un seul type cellulaire à la fois. Ce protocole peut être développé pour inclure 2 à 3 types cellulaires supplémentaires qui s'agrègent en une structure tridimensionnelle de base. Des modèles 3D plus complexes, tels que les organoïdes ou les systèmes de microfluidique, sont des systèmes multicellulaires qui reproduisent la diversité cellulaire et l'organisation d'organes spécifiques, contenant 10 types cellulaires distincts ou plus disposés selon des motifs semblables à ceux des tissus. De tels organoïdes 3D avancés peuvent inclure plusieurs cellules27, des cultures encapsulées dans des hydrogels, des techniques en goutte pendante et des plateformes de microfluidique11,27,28. Bien que ces méthodes offrent une architecture tissulaire plus complexe pouvant contribuer à approfondir notre compréhension de la biologie des AAV, elles nécessitent généralement des réactifs et un équipement spécialisés, ainsi qu'une expertise technique considérable. En revanche, les sphéroïdes 3D formés dans des plaques à adhérence ultra-basse sont nettement plus simples et conviennent à de nombreux laboratoires en raison de leur faible coût et de leur reproductibilité.
Les étapes critiques pour la mise en œuvre réussie de ce protocole incluent le maintien d'une viabilité cellulaire élevée, car les cellules altérées peuvent compromettre la formation des sphéroïdes et l'efficacité de la transduction. L'utilisation de plaques à adhérence ultra-basse et l'optimisation de la centrifugation sont également essentielles pour obtenir une compacité adéquate des sphéroïdes. L'optimisation du MOI pour chaque type cellulaire et sérotype d'AAV est indispensable afin d'éviter des signaux faibles ou une saturation. Le choix de la méthode de détection appropriée est également crucial, en particulier pour les analyses cinétiques, où une compatibilité avec les systèmes d'imagerie en temps réel continue des cellules vivantes est requise. Plusieurs considérations techniques sont importantes pour une interprétation précise de la transduction par l'AAV dans les sphéroïdes tridimensionnels.
Un signal de transduction faible ou absent peut résulter d'un faible titre viral, d'un MOI sous-optimal ou d'un temps d'incubation insuffisant ; cela peut être corrigé en vérifiant les titres viraux, en optimisant le MOI et en prolongeant le temps d'incubation (généralement 3 à 5 jours). Des signaux de fluorescence ou de luminescence faibles peuvent refléter une faible expression du transgène ou une pénétration limitée des réactifs au sein de la structure tridimensionnelle, ce qui peut être amélioré en optimisant les paramètres d'exposition ou en accordant davantage de temps à la diffusion du substrat. Un défi majeur dans certaines lignées cellulaires, comme les cellules HeLa, est l'autofluorescence, qui peut entraîner un signal de fond élevé et une sensibilité réduite dans les tests basés sur la fluorescence. Pour pallier cette limitation, nous avons mis en œuvre un système de rapporteur nanoluciférase basé sur la luminescence, qui offre un meilleur rapport signal sur bruit et permet une détection plus précise de la transduction dans des fonds autofluorescents. En outre, le signal de fond peut provenir d'un seuil mal défini ou d'une fluorescence liée au milieu, et doit être contrôlé à l'aide de puits non traités (MOI = 0) afin de définir les niveaux de base. Enfin, une saturation du signal à des MOI élevés peut survenir en raison d'une quantité excessive de virus ou de limitations du détecteur ; cela peut être atténué en réduisant la gamme de MOI et en optimisant les paramètres d'exposition du détecteur pour maintenir les mesures dans la plage dynamique linéaire.
Dans l'ensemble, cette méthodologie de sphéroïdes en 3D fournit un système rationalisé et reproductible pour évaluer la transduction, la puissance et la cinétique des AAV. En comblant l'écart entre les essais conventionnels en 2D et les études in vivo, elle permet un développement plus éclairé des vecteurs et soutient l'avancement de stratégies de thérapie génique pertinentes sur le plan clinique.

Les vecteurs AAV sont devenus l'un des systèmes de transfert génique privilégiés pour les applications in vivo en raison de leur profil de sécurité et de leur capacité à assurer une expression génique persistante1. La thérapie génique par AAV connaît des succès dans le traitement de plusieurs maladies rares, avec des centaines de produits en cours de développement2. De plus, des applications émergentes incluent la livraison in vivo de composants d'édition du génome tels que Cas9, offrant un fort potentiel pour aider au traitement de pathologies difficiles à traiter3. Les principaux défis du développement comprennent les coûts élevés de fabrication et la capacité limitée des essais in vitro actuels à prédire la qualité du produit et l'efficacité clinique4.
Le développement des thérapeutiques à base d'AAV est fondamentalement limité par l'absence de tests d'activité prédictifs et normalisés capables de prévoir avec précision les performances cliniques4,5. Ces tests constituent un élément essentiel du processus de développement, car ils sont utilisés à plusieurs fins, notamment le criblage de bibliothèques de vecteurs conçus, l'optimisation des modifications de la capside pour améliorer le ciblage, et l'évaluation de la tropisme tissulaire spécifique. Ils permettent également de caractériser l'influence des séquences régulatrices sur l'expression du transgène6. Au-delà du choix des candidats, les tests de transduction par l'AAV contribuent également de manière cruciale au contrôle qualité de la fabrication, grâce à des tests de puissance utilisés pour la libération des lots, les études de comparabilité entre lots et les évaluations de stabilité6,7.
Le défi scientifique consiste à développer des tests capables de saisir la complexité des interactions vecteur-hôte tout en restant réalisables dans la pratique pour une utilisation courante7,8. Les approches actuelles incluent l'utilisation de lignées cellulaires immortalisées représentant l'organe cible dans des cultures traditionnelles en monocouche bidimensionnelle. Ces conditions de culture manquent de pertinence physiologique et nécessitent des doses élevées de médicaments, ce qui crée un écart important entre les prédictions de laboratoire et la transposabilité clinique. De nouvelles lignées cellulaires conçues, telles que les systèmes surexprimant AAVR ou activés par CRISPR, constituent des progrès importants, mais ne parviennent pas à reproduire l'architecture tridimensionnelle et les interactions avec la matrice extracellulaire caractéristiques des tissus natifs9,10,11. Des modèles de nouvelle génération capables de mieux simuler les microenvironnements in vivo pourraient combler cet hiatus translationnel12,13,14.
Nous avons récemment mis au point un système de sphéroïdes tridimensionnels optimisé pour la transduction par les AAV afin d'améliorer la transposabilité des tests de transduction par les AAV. Ce système améliore de manière significative l'efficacité de la transduction par les AAV dans plusieurs lignées cellulaires et sérotypes d'AAV par rapport aux tests bidimensionnels considérés comme la norme. En plus d'une sensibilité accrue et d'une meilleure conservation du produit utilisé dans le test, ces modèles surpassent les monocouches bidimensionnelles en offrant des interactions cellulaires réalistes, variables selon la localisation cellulaire au sein du sphéroïde. Ils permettent également une étude pertinente de la pénétration des médicaments, simulant des conditions organiques réelles11,15,16. Par ailleurs, cette approche par sphéroïdes présente des avantages pratiques par rapport à des systèmes plus complexes comme les organoïdes ou les cocultures, car elle utilise du matériel de laboratoire standard et ne nécessite ni milieu spécialisé ni support particulier. Cette simplicité garantit reproductibilité et possibilité de mise à l'échelle, ce qui la rend particulièrement adaptée aux tests de thérapie génique de routine et aux procédés de développement de vecteurs17.
Cette plateforme en sphéroïdes tridimensionnels est particulièrement bien adaptée aux applications nécessitant une détection sensible de la transduction par les AAV à faible dose et à l'évaluation comparative de conceptions de génomes viraux. Elle permet également d'évaluer le tropisme dépendant du sérotype. Elle est particulièrement avantageuse pour les lignées cellulaires présentant une efficacité de transduction relativement faible et nécessitant de fortes doses d'AAV dans les cultures conventionnelles en deux dimensions. Dans ces contextes, la sensibilité accrue et la pertinence physiologique améliorée de la plateforme tridimensionnelle sont essentielles. Toutefois, ce système peut être moins adapté aux études nécessitant des composants immunitaires, une distribution vasculaire ou une complexité tissulaire complète. En effet, les sphéroïdes ne reproduisent pas intégralement l'environnement in vivo&#160;.
Ainsi, nous présentons un protocole simple de sphéroïdes tridimensionnels optimisé pour les tests de transduction par AAV, comportant deux lectures critiques et complémentaires : l'efficacité de la transduction (définie ici comme le signal rapporteur total par sphéroïde) et la cinétique de transduction. Cette méthode fournit une plateforme rentable, physiologiquement pertinente et informative pour l'évaluation de la puissance des AAV, la conception de vecteurs et les tests de neutralisation.

<table><tbody><tr><td>Incubateur à 37 °C</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#51025983</td><td>Conditions standard de culture</td></tr><tr><td>Cellules A375</td><td>ATCC</td><td>CRL-1619</td><td>Ligne cellulaire</td></tr><tr><td>Plasmide AAV1</td><td>Addgene</td><td>112862</td><td>Plasmide AAV</td></tr><tr><td>Plasmide AAV2</td><td>Addgene</td><td>104963</td><td>Plasmide AAV</td></tr><tr><td>Plasmide AAV5</td><td>Addgene</td><td>104964</td><td>Plasmide AAV</td></tr><tr><td>Plasmide AAV8</td><td>Addgene</td><td>112864</td><td>Plasmide AAV</td></tr><tr><td>Plasmide AAV9</td><td>Addgene</td><td>112865</td><td>Plasmide AAV</td></tr><tr><td>Lecteur de plaques BioTek GEN5</td><td>Agilent Technologies</td><td>NA</td><td>Lecture finale de fluorescence ou de luminescence</td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#TSO-MX1R</td><td>Maintien de la suspension des sphéroïdes</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS) pour culture cellulaire Corning&amp;trade; (1X)</td><td>Fisher Scientific</td><td>#MT21040CMX</td><td>PBS pour rincer les cellules</td></tr><tr><td>DMEM à forte teneur en glucose, supplément GlutaMAX, pyruvate</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#10569010</td><td>Milieu de croissance complet</td></tr><tr><td>Inhibiteur extracellulaire NanoLuc&amp;nbsp;</td><td>Promega</td><td>N235B</td><td>Éteint tout signal NanoLuc&amp;reg; provenant de l’environnement extracellulaire&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#F4135-500mL</td><td>Fournit des facteurs de croissance</td></tr><tr><td>Cellules HEK293T</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td>Ligne cellulaire</td></tr><tr><td>Cellules HeLa</td><td>ATCC</td><td>CRM-CCL-2</td><td>Ligne cellulaire</td></tr><tr><td>Cellules HEP3B</td><td>ATCC</td><td>HB-8064</td><td>Ligne cellulaire</td></tr><tr><td>Cellules HEPG2</td><td>ATCC</td><td>HB-8065</td><td>Ligne cellulaire</td></tr><tr><td>Cellules Huh7</td><td>ABM</td><td>T8973</td><td>Ligne cellulaire</td></tr><tr><td>Microscope inversé IncuCyte S3</td><td>Sartorius</td><td>NA</td><td>Surveillance de la formation et de la croissance des sphéroïdes</td></tr><tr><td>Imager IVIS Spectrum</td><td>Spectralinvivo</td><td>NA</td><td>Lecture finale de la luminescence</td></tr><tr><td>Kit d’essai Nano-Glo&amp;reg; pour cellules vivantes&amp;nbsp;</td><td>Promega</td><td>N2013</td><td>Réactif substrat luminescent pour la détection en cellules vivantes</td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/mL)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td># 15140122</td><td>Prévention de la contamination bactérienne</td></tr><tr><td>Flacons de culture tissulaire T75 avec ventilation</td><td>Fisher Scientific</td><td>#NC0509296&amp;nbsp;</td><td>Flacons pour la culture cellulaire</td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA (0,05 %)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#25300120</td><td>Détachement enzymatique des cellules</td></tr><tr><td>Plaques à adhérence ultra-faible</td><td>Corning</td><td>#7007</td><td>Prévention de l’adhérence cellulaire pour favoriser la formation de sphéroïdes</td></tr></tbody></table>

Évaluation de sphéroïdes 3d pour des études de transduction par aav

Evaluation of 3D Spheroids for AAV Transduction Studies

Les virus adéno-associés (AAV) sont des vecteurs puissants utilisés pour la livraison de gènes dans les produits de thérapie génique. Leur développement nécessite des systèmes in vitro&#160;capables de détecter de manière fiable les différences dans la conception du vecteur, la performance du sérotype, la force des éléments régulateurs et la cinétique d'expression. Ces systèmes doivent également permettre des applications telles que l'évaluation de la puissance et l'optimisation du vecteur. Nous décrivons ici une plateforme simplifiée en trois dimensions, sous forme de sphéroïdes, optimisée pour évaluer la puissance des AAV, la cinétique d'expression du transgène et l'efficacité de transduction spécifique à chaque sérotype dans diverses lignées cellulaires. Des sphéroïdes uniformes sont générés à l'aide de plaques à adhérence ultra-faible et maintenus dans des conditions favorisant une architecture stable et un imagerie à long terme. Après la transduction par les AAV, les signaux fluorescents ou luminescents sont surveillés en temps réel à l'aide de systèmes d'imagerie de cellules vivantes. Cela permet une évaluation quantitative du signal rapporteur, de la réponse à la dose, de l'activité des éléments régulateurs et du délai d'apparition grâce à une imagerie cinétique continue. La plateforme permet de distinguer efficacement les conceptions de génomes vecteurs puissants de celles qui sont faibles, ainsi que différents sérotypes d'AAV. Cette méthode montre des performances robustes, tant sur des lignées cellulaires à division lente que rapide. Ces résultats établissent son utilité comme système évolutif et physiologiquement pertinent pour l'évaluation et le développement précliniques de thérapies géniques.

Les systèmes de culture tridimensionnels en sphéroïdes améliorent les modèles conventionnels en 2D pour le développement de la thérapie génique par AAV. Cette méthodologie permet une détection sensible de la transduction par l'AAV à faibles doses, une pertinence physiologique accrue et une surveillance robuste à long terme. La plateforme permet l'évaluation de la puissance, le criblage à haut débit et l'optimisation des vecteurs sur diverses lignées cellulaires et sérotypes d'AAV.

Évaluation de sphéroïdes 3D pour des études de transduction par AAV

Les virus adéno-associés (AAV) sont des vecteurs puissants utilisés pour le transfert de gènes dans les produits de thérapie génique. Leur développement nécessite des systèmes in vitro qui...

Nous avons mis au point une plateforme sensible et physiologiquement pertinente en 3D sous forme de sphéroïdes pour évaluer l'activité de transduction des AAV et améliorer la prédiction de la performance des vecteurs en thérapie génique. Ce protocole s'applique à l'évaluation de l'activité des AAV lors des tests de puissance des vecteurs, du criblage des sérotypes, de l'optimisation du transgène, des études de neutralisation et de la thérapie génique préclinique in vitro.Pour commencer, cultiver les cellules dans un flacon de culture de 75 cm² jusqu'à ce qu'elles atteignent une confluence de 70 % dans des conditions standard. Après la trypsination des cellules, préparer une dilution de 1 à 10 pour le passage cellulaire habituel. Incuber à nouveau les cellules jusqu'à atteindre une confluence de 70 %, puis les récolter. Après avoir évalué la viabilité cellulaire, pipeter soigneusement la suspension cellulaire afin de garantir un mélange homogène. Réaliser des dilutions sérielles par doublement des cellules dans une plaque 96 puits à attachement ultra-faible, en commençant avec 1 × 10⁴ cellules par puits dans un volume de 200 µL. Selon le schéma expérimental indiqué, ajouter un volume de milieu complet dans toutes les rangées sauf la rangée supérieure. Ensuite, ajouter deux volumes de 1 × 10⁴ cellules par puits dans la rangée supérieure. Diluer sériellement la rangée 1A en ajoutant un volume de la rangée 1A dans la rangée 1B, et continuer de la même manière. Centrifuger la plaque à attachement ultra-faible à 350 × g pendant cinq minutes afin de regrouper les cellules au centre et favoriser le contact cellule-cellule. Incuber à 37 °C, sans perturbation, pendant 24 à 48 heures pour la formation des sphéroïdes. Laisser trois jours afin que le diamètre atteigne environ 400 µm. Vérifier l'uniformité de la taille des sphéroïdes, en s'assurant que les cellules sont bien resuspendues et que les plaques sont à plat. Surveiller la morphologie des sphéroïdes. Sélectionner les sphéroïdes matures qui présentent une forte adhésion cellule-cellule plutôt que des agrégats cellulaires lâches.Une fois les suspensions cellulaires centrifugées, transférez la plaque dans un incubateur à 37 degrés Celsius équipé d’un instrument d’imagerie en temps réel pour cellules vivantes. Connectez-vous au logiciel d’acquisition. Sélectionnez Planifier l’acquisition et Analyser selon le planning, puis choisissez Créer un récipient comme Nouveau. Ensuite, sélectionnez le type d’analyse et choisissez sphéroïde. Choisissez les canaux d’intérêt. Sélectionnez le contraste de phase en champ clair. Puis sélectionnez vert ou rouge. Réglez le grossissement souhaité à 10x. Choisissez le modèle de plaque et sa position dans le tiroir. Sélectionnez les puits à imager et saisissez le nom de l’expérience. Pour la configuration de l’analyse, sélectionnez Analyse différentielle à reporter ultérieurement. Réglez les analyses pour qu’elles soient ajoutées toutes les six heures et poursuivez l’analyse indéfiniment. Vérifiez quotidiennement la croissance des sphéroïdes en vous connectant au logiciel d’imagerie. Sélectionnez Afficher les analyses récentes et double-cliquez sur l’expérience souhaitée. Après avoir sélectionné Champ clair dans le panneau des canaux d’image, utilisez la fonction Mesurer l’image pour mesurer les diamètres des sphéroïdes. Retirez la plaque le jour de la formation optimale des sphéroïdes et utilisez-la pour la transduction par le virus adéno-associé, ou AAV.Préparez une plaque de 96 puits à fond rond contenant 297 microlitres de DMEM supplémenté avec 2 % de FBS et sans antibiotiques. Ajoutez 33 microlitres de stock d'AAV au milieu afin d'obtenir une multiplicité d'infection initiale, ou MOI, de 1 fois 10 à la puissance 6. Préparez ensuite des dilutions sérielles dix fois plus faibles en transférant 33 microlitres de chaque dilution dans 297 microlitres de milieu. Aspirez complètement le milieu de la plaque de sphéroïdes préparée précédemment à l’aide d’une pipette multicanal. Transférez 100 microlitres de l'AAV au MOI souhaité depuis la plaque de dilution vers la plaque de traitement en utilisant une pipette multicanal. Replacez les plaques dans l'appareil d'imagerie. Commencez le suivi de la transduction en mesurant l'intensité fluorescente verte pendant 72 heures. Ajoutez 100 microlitres de DMEM complet par puits tous les trois jours afin de renouveler les nutriments. Replacez la plaque dans l'appareil d'imagerie et commencez à enregistrer l'efficacité de la transduction toutes les six heures. Analysez les données en créant une définition d'analyse spécifique aux cellules et aux gènes rapporteurs d'intérêt. Réalisez une analyse en point final à l’aide de lectures de fluorescence. De manière similaire, effectuez la transduction par AAV dans des sphéroïdes tridimensionnels portant des rapporteurs luminescents, suivie d'une analyse de la transduction par imagerie bioluminescente.Chaque lignée cellulaire présentait des caractéristiques morphologiques distinctes et des niveaux de compaction variables après trois jours d'ensemencement. Les lignées cellulaires hépatiques formaient des sphéroïdes plus compacts et plus denses que les autres lignées cellulaires. HEK293T formait une apparence sphérique très ronde avec un noyau nécrotique bien défini. A375 formait un agrégat cellulaire de forme irrégulière. Les sphéroïdes étaient très sensibles à la transduction par AAV, une forte transduction étant détectée à de très faibles titres d'AAV dans différentes lignées cellulaires pour la GFP auto-complémentaire. La transduction des sphéroïdes par la GFP simple brin était observée à des niveaux inférieurs à ceux de la GFP auto-complémentaire. Une différence de 100 fois dans la fluorescence relative a été observée entre les transgènes auto-complémentaires et simple brin à un MOI de 10 à la puissance 6 dans les cellules HEK293T. Une différence de trois fois dans la fluorescence relative a été observée entre les transgènes auto-complémentaires et simple brin dans les cellules HEP3B. Les quatre sérotypes d'AAV ont été détectés avec succès à l'aide du lecteur de plaques fluorescent et du système d'imagerie en temps réel. L'AAV2 a montré l'efficacité de transduction la plus élevée, suivie par l'AAV1 dans les deux lignées cellulaires. Tous les sérotypes d'AAV ont montré une transduction efficace en utilisant le système luminescent, permettant une différenciation précise de l'efficacité de transduction. L'AAV2 était le sérotype le plus efficace dans les sphéroïdes HeLa, tandis que l'AAV9 présentait la plus faible efficacité de transduction. La transduction par AAV2 GFP auto-complémentaire était détectable à des taux d'infection aussi bas que 10 à la puissance 1, avec une augmentation notable du signal après environ 34 heures par rapport aux cellules non traitées. Le signal de la GFP simple brin AAV2 était plus faible et plus lent que celui de la GFP auto-complémentaire.Le défi principal lors de la réalisation de ce protocole consiste à maintenir une viabilité cellulaire élevée, à produire des sphéroïdes uniformes et compacts, et à optimiser la dose d'AAV pour chaque type cellulaire et sérotype. Ce protocole permet d'évaluer l'expression et la fonctionnalité du transgène à l'aide de RT-qPCR, de western blot, de dosages ELISA et de tests d'activité somatique, ainsi que d'une analyse cinétique du délai d'apparition. De futures études pourront intégrer des cultures mixtes, des organoïdes, de la microfluidique, des cellules immunitaires ou un réseau vasculaire afin de mieux imiter le microenvironnement in vivo.

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