Reprogrammation de lignées de cellules souches pluripotentes induites à partir d’échantillons de Buffy Coat gelés

Le but de ce protocole est de reprogrammer les manteaux buffy congelés humains ou PBMC en cellules souches pluripotentes induites. Ce protocole purifie de manière unique les pelages buffy après dégel et identifie une morphologie cellulaire somatique indiquant un succès de reprogrammation. Pour commencer, récupérez le manteau buffy gelé issu du sang humain et placez-le sur la glace.

Faites doucement tourner l’échantillon dans un bain-marie à 37 degrés Celsius et retirez le flacon lorsqu’il ne reste plus qu’un petit cristal de glace. Transférez soigneusement le contenu du flacon goutte par goutte dans un tube conique contenant 12 millilitres de DPBS. Rincez le flacon avec un millilitre de DPBS, puis ajoutez le rinçage au tube conique contenant les cellules récupérées.

Centrifugez l’échantillon à l’aide d’un rotor à seau pivotant à 200 g à température ambiante pendant 10 minutes. Retirez soigneusement le surnageant et resuspendez la pellete cellulaire dans quatre millilitres de DPBS contenant 1 % de FBS. Ensuite, superposez doucement le mélange de couche buffy sur trois millilitres de solution à gradient de densité, évitant le mélange à l’interface.

Centrifugeuse à l’aide d’un rotor à seau oscillant à 800 g pendant 20 minutes à température ambiante, le frein désactivé. À l’aide d’une pipette, retirez et éliminez la couche supérieure de plasma sans perturber l’interface de plasma à gradient. Ensuite, retirez la cellule mononucléaire du sang périphérique, ou couche PBMC à l’interface, et transférez-la dans un tube propre de 15 millilitres.

Lavez les PBMC en ajoutant trois millilitres de milieu d’expansion et centrifugez à 200 g pendant 10 minutes à température ambiante. Retirez soigneusement le surnageant et resuspendez la pellete dans deux millilitres de milieu d’expansion contenant des cytokines telles que SCF, IL-3, EPO et IGF-1. Placez les cellules dans un puits d’une plaque à 12 puits.

Cultivez les cellules à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone et 20 % d’oxygène pendant 10 à 14 jours. Remplacer la moitié du milieu tous les deux jours jusqu’à ce qu’une population dense d’érythroblastes ronds et brillants soit observée, indiquant que les cellules sont prêtes à la transduction. Trois jours après la transduction avec le virus Sendai porteur des facteurs Yamanaka, placez les cellules sur des fibroblastes embryonnaires de souris à deux millilitres par puits.

Incubez les cultures pendant environ sept jours, en nourrissant les colonies émergentes avec des milieux hESC tous les deux jours. Placez la plaque contenant les cellules transduites et les colonies émergées sous un microscope disséquant. Utilisez le microscope pour localiser une colonie afin de soulever et de soulever le couvercle de la plaque pour exposer le puits.

Ouvrez la seringue de façon aseptique et exposez l’aiguille. Guidé par le microscope, utilisez la pointe de l’aiguille pour détacher la colonie des cellules nourricières environnantes en suivant le contour de la colonie. Utilisez la pointe de l’aiguille pour couper la colonie en quelques morceaux de taille égale.

Si les morceaux ne se sont pas détachés, utilisez le côté de l’aiguille pour les retirer ou les gratter de la plaque jusqu’à ce qu’ils flottent. À l’aide d’une pipette P200, localiser la colonie piquée au microscope, aspirer la colonie flottante avec la pipette, puis la transférer dans un puits de la plaque préparée à 24 puits. Assurez-vous que toute la colonie soit transférée sans avoir à collecter d’autres colonies ou cellules nourrissantes.

Placez la plaque dans l’incubateur à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone et 20 % d’oxygène jusqu’à obtenir la confluence souhaitée. Identifiez les colonies grandes, rondes et présentant des bords lumineux comme prêtes à se fendre. Aspirez le substrat du puits et rincez l’échantillon une fois avec un millilitre de DPBS.

Ensuite, retirez le DPBS et ajoutez 500 microlitres de tampon de dissociation EDTA à 0,5 millimolaire. Incubez l’échantillon à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant deux minutes, jusqu’à ce que les colonies se relâchent et que les cellules s’enroulent. Ensuite, retirez la plaque de l’incubateur et aspirez le tampon de dissociation de l’EDTA.

À l’aide d’une pipette P1000, collectez les cellules avec un millilitre de milieu pluripotent humain en pipettant doucement de haut en bas jusqu’à ce que les colonies soient détachées et légèrement brisées. Transférer le millilitre de milieu et les cellules dans une nouvelle plaque à six puits contenant un millilitre de milieu cellulaire pluripotent humain frais. Placez les cellules dans l’incubateur à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone et 20 % d’oxygène.

Nourrissez quotidiennement des cellules souches pluripotentes induites jusqu’à ce que le puits soit confluent et prêt à se diviser. Entre-temps, enrobez un plat de 10 centimètres de 7 millilitres de solution de vitronectine de cinq microgrammes par millilitre préparée dans le DPBS et faites-le couver à température ambiante pendant une heure. Pour continuer la séparation, ajoutez 7 à 10 millilitres de milieu pluripotent humain à la plaque de 10 centimètres et transférez les cellules de la plaque à six puits à la boîte dans un ratio 1:1, puis incubez comme démontré précédemment.

Confirmez que les cellules de la boîte de 10 centimètres sont confluentes avant de les séparer à nouveau. Ajustez le ratio de séparation en fonction de la morphologie et de la densité cellulaires, généralement en utilisant un ratio 1:10, et notez le numéro de passage à chaque passage. Enfin, caractérisez les cellules souches pluripotentes induites en confirmant l’expression du marqueur de souche NANOG à l’aide de l’immunofluorescence.

Différenciez les cellules en lignées ectodermes, mésodermes et endodermes en utilisant des conditions de culture définies. Évaluer le potentiel de différenciation en colorant PAX6, Brachyury et SOX17, ainsi que la perte d’expression de NANIG. À la fin de l’expansion, les PBMC se sont différenciés en érythroblastes, apparaissant comme des cellules brillantes et rondes de taille grande et petite.

Alors que les cultures dépourvues de ces cellules ou semblant mortes avaient peu de chances de se reprogrammer avec succès. La transduction et la reprogrammation réussies ont été marquées par l’émergence de colonies pluripotentes induites sur des cellules nourricières irradiées, qui ont ensuite développé la morphologie typique des cellules souches. Tandis que les cellules n’adoptant pas une morphologie similaire à celle des cellules souches n’ont pas été reprogrammées avec succès.

Les cellules souches pluripotentes induites reprogrammées avec succès présentaient des colonies denses et rondes aux bords lisses et brillants. Les sous-clones à morphologie moins idéale, tels que la différenciation spontanée ou les centres denses, ont été éliminés en ajustant les conditions de scission. Certaines colonies choisies n’ont pas réussi à s’étendre.

En plus de la morphologie, les cellules souches pluripotentes induites présentaient une sojme, comme en témoigne l’expression du marqueur de tige NANOG. Les cellules souches pluripotentes induites reprogrammées ont démontré un potentiel de différenciation en ectoderme, mésoderme et endoderme. Ce protocole fournit des points de contrôle détaillés pour suivre et prédire le succès de la reprogrammation.

Pour confirmer davantage qu’une lignée iPSC est adaptée à l’utilisation, il convient de réaliser un caryotypage, un génotypage et des tests réguliers de mycoplasme. Ce protocole permet de reprogrammer à partir de populations de patients existantes avec des manteaux buffy biobanqués, élargissant ainsi l’utilité de la technologie iPSC.