Utilisation de la RMN en solution pour caractériser les condensats biomoléculaires dans des conditions biphasiques

Nous avons développé des méthodes RMN pour étudier les condensats biomoléculaires. Celles-ci sont essentielles à l’organisation cellulaire, mais leur information constante est impliquée dans de multiples troubles. Grâce à nos méthodes, nous étudions les propriétés des matériaux condensés, analysons le mécanisme de leur formation et surveillons les changements à long terme tels que la maturation du condensat ou la fibrillation pathologique des biomolécules.

Pour commencer, préparez l’échantillon biphasique final stabilisé par de l’hydrogel d’agarose en mélangeant les stocks de protéines, d’ARN ou les deux avec le tampon d’agarose chaud respectif dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre. La concentration finale de protéine, ou d’ARN, est généralement de 50 à 500 micromolaires pour la détection RMN. Insérez l’échantillon biphasique préparé dans un spectromètre, puis verrouillez, calez, correspondez et accordez le canal de protons comme d’habitude.

Calibrez la longueur d’impulsion de 90 degrés sur le canal de protons en utilisant la procédure générale d’étalonnage. Ensuite, enregistrez un spectre à une dimension avec suppression d’eau et vérifiez si ce spectre contient de forts signaux biomoléculaires. Si aucun signal n’est observé ou très faible, ne procédez pas à REDIFINE, mais utilisez plutôt le CONDENSE-MT.

Enregistrez une expérience de spectroscopie ordonnée par diffusion pour calculer la intensité du gradient de diffusion de 2 à 95 % en 16 étapes linéaires. Pour continuer à acquérir des données pour l’ensemble complet de REDIFINE, créez neuf nouvelles expériences PPP GPQ S19 en copiant les paramètres de l’expérience initiale qui vient d’être réalisée. Dans chaque expérience consécutive, ne modifier que le délai de diffusion D20 par étapes variables pour couvrir la plage de 100 à 1000 millisecondes.

Exécutez chacune de ces expériences avec la commande appropriée. Utilisez le dernier N pour préserver le gain du récepteur tout au long des 10 expériences. Définissez le signe Q avec SSB2 comme fonction fenêtre.

Ensuite, extraire la cinquième tranche en utilisant la commande appropriée. Phasez le spectre unidimensionnel et enregistrez les paramètres de phasage dans le jeu de données bidimensionnel. Traiter le jeu de données bidimensionnel avec le XF2 et effectuer la correction de base avec ABS2.

Ensuite, extrais les 16 tranches avec du split 2D. Répétez la procédure similaire pour les neuf expériences restantes. Vérifiez au moins les quatre à cinq premières tranches pour vous assurer que le phasage et la correction de base sont corrects.

Si besoin, corrigez manuellement le phasage et la baseline. Ensuite, utilisez le code MATLAB approprié pour l’analyse. Dans le code, modifiez les temps de diffusion, définissez les valeurs PG selon les intensités du gradient de la sonde et assignez les expériences de un à dix en fonction du nombre total d’expériences.

Ensuite, ajuster les données selon le modèle REDIFINE en utilisant ce code. Enregistrez le spectre 1D avec suppression d’eau. Si très peu de signal est observé, procédez à l’expérience CONDENSE-MT.

Déterminer le taux R1 de l’eau par récupération par inversion T1 pour le CONDENSE-MT quantitatif. Copiez la séquence d’impulsions fournie et la liste des VD dans les dossiers respectifs. Après avoir calibré l’impulsion protonale à 90 degrés, réglez NS à 2, DS à 0, D1 à 20 secondes, SW à 10 parties par million.

TD2 à 16K et TD1 à 24. Pour l’expérience CONDENSE-MT, copiez l’ensemble de paramètres de Bruker, la séquence et la liste de fréquence fournis dans les dossiers spécifiques à Bruker. Ensuite, ajustez les fréquences et la puissance selon le spectromètre.

Régler P1 sur la longueur d’impulsion calibrée de 90 degrés et P4 sur une microseconde pour l’impulsion d’excitation afin d’éviter l’amortissement des radiations. Réglez NS à 2, DS à 16, D1 à quatre secondes, SW2 à 20 parties par million, TD2 à 8k, et TD1 à la longueur de la liste de fréquences. Réglez SPNAM10 à Squa100, 000, et réglez P10 à cinq secondes.

Trouvez la puissance SP10 qui produit des irradiations de 100 hertz. Ajustez la puissance SP10 de l’impulsion d’irradiation en conséquence. Exécutez l’expérience pseudo bidimensionnelle avec la commande appropriée et mettez en place une série de ces expériences pseudo 2D, variant les puissances d’irradiation SP10.

Après avoir ajusté tous les paramètres, exécutez le code pour lire les spectres RMN, qui intègre le signal de l’eau et le sauvegarde dans une nouvelle variable. Lors de la récupération par inversion de code, ajustez le chemin vers les données appropriées et vérifiez la région d’intégration de l’eau. Ajustez ensuite le numéro d’expérience contenant les données de récupération par inversion.

Définissez tous les paramètres expérimentaux et entrez les valeurs du pool vide d’agarose précédemment obtenues en ajustant le jeu de données d’agarose de manière similaire. Exécutez la première section du code vide condensé pour obtenir l’ajustement à la relaxation longitudinale de l’eau. Ensuite, faites passer la section de raccord vide condensé pour initier la figure en direct, montrant la minimisation de la fonction d’ajustement.

Exécutez la section suivante du code pour déterminer les incertitudes et tracer les données. L’ajustement REDIFINE a déterminé les coefficients de diffusion dans les phases diluée et condensée, la population de protéines dans la phase condensée, la taille moyenne des gouttelettes et la perméabilité en interphase pour l’échantillon du domaine N-terminal de la FUS. Le signal RMN du domaine terminal N du FUS est resté détectable en phase condensée.

Aucune différence dans le profil de transfert de magnétisation n’a été observée entre la référence agarose et le domaine N-terminal FUS par échantillon phasique. Pour les condensats d’ARN répétés du CAG, aucun signal RMN n’est observé. En conséquence, le profil de transfert de magnétisation est significativement différent de la référence agarose.

L’expérience CONDENSE-MT a permis une caractérisation dynamique des condensats d’ARN à expansion répétée. L’analyse CONDENSE-MT a révélé la cinétique d’échange de protons entre le condensat et l’eau en vâcle. L’analyse CONDENSE-MT a également donné le temps de relaxation transversale de l’ARN dans le condensat et le taux apparent de relaxation transversale de l’eau en vrac.

Dans ce protocole, nous pouvons caractériser la propriété du condensat dans un état biphasique sans avoir besoin d’un tag chimique. Les gouttelettes coexistent avec un environnement dilué, permettant l’échange entre les deux phases en imitant l’environnement cellulaire. Nos méthodes axées sur la caractérisation des condensats peuvent être complétées par des méthodes conventionnelles de RMN pour étudier les interactions et dynamiques de la structure moléculaire à travers les phases.

Dans de futures études, nous visons à développer des modèles de condensat plus complexes, en adaptant la méthodologie à des systèmes plus complexes, et à étudier finalement le condensat directement dans leurs environnements incellulaires.