Extraction d’ADN de colonne à débit moyen utilisant des racks à 24 puits

Notre recherche porte sur des supports imprimés en 3D pour l'extraction par colonne à rotation parallèle de l'ADN et de l'ARN, combinant les méthodes manuelles et automatisées. Cet article répond à la limitation des méthodes manuelles par colonne à rotation, qui sont laborieuses, en permettant le traitement simultané de jusqu'à 116 échantillons d'ADN ou d'ARN. Pour commencer, utilisez une imprimante 3D à filament fondu équipée d'une buse de 0,4 millimètre pour imprimer le support.

Utilisez un filament en polylactide générique, ou PLA, en polyéthylène téréphtalate glycolé, ou PETG, ou en acrylonitrile butadiène styrène, ou ABS, avec un remplissage de 100 %. Réglez la hauteur de couche à 0,1 millimètre et activez le lissage de surface. Ajustez les paramètres d'impression pour garantir l'étanchéité à l'eau et la stabilité mécanique.

Tester l'étanchéité des supports avant de les utiliser pour la première fois. Remplir le réservoir imprimé avec de l'éthanol à 70 % pour le tester avant utilisation. Effectuer une centrifugation pendant des durées progressivement croissantes afin de confirmer l'absence de fuite ou de dommage structurel.

Après avoir effectué avec succès le test à l'aide de la colle, assembler les composants du réservoir de base afin de former un ensemble étanche. Inoculer une transformation d'Escherichia coli, ou E. coli, dans trois à cinq millilitres de bouillon de lysogénie, ou milieu LB, contenant les antibiotiques appropriés. Incuber la culture pendant 12 à 16 heures à 37 degrés Celsius sous agitation.

Centrifuger à 2000 ×g pendant 10 minutes pour récolter les cellules. Éliminer le surnageant. Ajouter 250 microlitres de tampon de resuspension au culot.

Et re-suspendre complètement le culot par vortexage ou pipetage. Ajouter 250 microlitres de tampon de lyse. Et mélanger délicatement en retournant le tube quatre à six fois ou en basculant la plaque à 24 puits.

Ajouter 350 microlitres de tampon de neutralisation et mélanger. Observer la formation d’un précipité blanc pour confirmer une neutralisation réussie. Ajouter le tampon de lyse dans un tube contenant de la poudre de dioxyde de titane.

Ajoutez un rapport volume sur masse de deux à un. Ajoutez 250 microlitres de la suspension de dioxyde de titane au lysat. Et mélangez en agitant le tube.

Ajoutez 350 microlitres de tampon de neutralisation et mélangez soigneusement. Effectuez une centrifugation à 2000 G pendant 10 minutes. Observez le culot cellulaire complètement précipité en présence de dioxyde de titane et le surnageant apparaissant parfaitement transparent.

En l'absence de dioxyde de titane, observez la présence de sédiment résiduel dans le surnageant. Récupérez le surnageant sans perturber le précipité et transférez-le sur la colonne de liaison. Placez les colonnes de liaison de l'ADN dans la couche support de colonne du porte-colonne.

Placer les couvercles des colonnes dans les fentes prévues à cet effet pour les sécuriser pendant la centrifugation. Insérer les colonnes de clarification ou de filtration dans la couche de colonnes filtrantes située directement au-dessus des colonnes de liaison. Transférer le lysat neutralisé préparé dans les colonnes de filtration.

Placer le support assemblé dans un rotor à godets oscillants. Centrifuger à 2000 G pendant une minute à température ambiante. Après avoir retiré le support de la centrifugeuse, enlever et jeter la couche de colonne filtrante.

Jetez le flux sortant du réservoir dans un contenant pour déchets. Réassemblez le support avec les colonnes de liaison. Ajoutez de 500 à 700 microlitres de tampon de lavage dans chaque colonne de liaison.

Centrifuger à 2000 ×g pendant une minute. Jeter le liquide de passage du réservoir et répéter l'étape de lavage comme précédemment démontré. Retirer les colonnes de liaison du support et les transférer dans des tubes de collecte de deux millilitres.

Centrifuger à 10 000 G ou plus pendant une minute pour sécher la membrane. Transférer les colonnes dans des tubes propres de 1,5 millilitre. Ajouter 50 microlitres de tampon d'élution ou d'eau directement sur la membrane et incuber les colonnes pendant une minute à température ambiante.

Centrifuger à 10 000 G ou plus pendant une minute pour éluer l'ADN. Le rendement total de plasmide n'a montré aucune différence significative entre la méthode conventionnelle et l'extraction utilisant les configurations de blocs. La confirmation du plasmide a été préservée avec des distributions similaires des formes relâchées, linéarisées et en superhélice.

La répartition du colorant était limitée à la zone de déchets directement sous les colonnes chargées, aucun signal visible n'ayant été détecté dans les puits adjacents ou sur les embouts des colonnes voisines, ce qui indique que la conception du support réduit le risque d'éclaboussures et de transfert entre colonnes. L'amplification n'a été détectée que dans les élutions provenant des colonnes auxquelles l'amplicon avait été ajouté. Cette particule permet aux chercheurs d'obtenir de l'ADN plasmidique de haute qualité pour des applications en aval, notamment le clonage, le séquençage et l'analyse par PCR.

La considération la plus importante lors de l'exécution de ce protocole consiste à prévenir la contamination croisée en utilisant un réservoir étanche, sans chevauchement, imprimé en 3D. En outre, après avoir suivi cette procédure, ces supports peuvent être utilisés pour toute analyse d'extraction d'acides nucléiques sur colonne.