Détection de la sénescence à l’aide de la lumière réfléchie dans la fraction vasculaire stromale adipeuse

Nous étudions la sénescence des adipocytes à travers différentes dépôts de graisse et conditions métaboliques, comme l’obésité et l’hyperinsulinémie. Les tests SABG traditionnels basés sur Brightfield ne permettent pas vraiment le multiplexage et sont très subjectifs. Notre nouveau protocole est moins subjectif et permet le multiplexage.

Pour commencer, récupérez le tube contenant le tissu adipeux humain. Homogénéisez 10 grammes de tissu adipeux et ajoutez-les à un tube contenant 0,05 % d’enzyme collagèneuse de type un pour obtenir environ un million de cellules de fraction vasculaire stromal, ou SVF. Aliquotes 500 000 cellules dans chaque tube de microcentrifuge de 1,5 millilitre.

Ajoutez un millilitre de paraformodéhyde à 2 % dans le tube pour la fixation cellulaire. Ensuite, faites couver sur un bascule à température ambiante pendant 20 minutes. Centrifugez à 600G pendant 10 minutes et retirez le surnageant.

Préparez la solution de coloration X-Gal à l’aide du kit de coloration bêta-galactosidase de sénescence selon les instructions du fabricant. Ajoutez un millilitre de la solution de coloration dans trois tubes frais. Et ajustez le pH à cinq, six et huit en utilisant une solution molaire d’acide chlorhydrique ou d’hydroxyde de sodium molaire.

Utilisez un pHmètre calibré pour vérifier le pH. Ajouter la solution de coloration X-Gal ajustée au pH à chacun des tubes étiquetés contenant 500 000 cellules. Incubez à 37 degrés Celsius pendant 24 heures sans dioxyde de carbone.

Centrifugez les cellules à 600G pendant 10 minutes. Après avoir retiré le surnageant, lavez les cellules avec du PBS. Et centrifugeuse à nouveau à 600G pendant 10 minutes.

Une fois le surnageant retiré, pour identifier les cellules endothéliales au sein de la SVF hétérogène, incubez les cellules avec des anticorps primaires IgG spécifiques aux cellules endothéliales CD31 ou contrôlez les anticorps primaires IgG à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Lavez les cellules trois fois avec 0,1 % de PBST pendant 10 minutes à température ambiante sur un bascule pour éliminer l’anticorps primaire non lié. Et centrifugeuse à 600G pendant 10 minutes.

Après avoir jeté le surnageant, incubez les cellules avec un anticorps secondaire pendant une heure à température ambiante sur un bascule. Centrifugez à 600G pendant 10 minutes pour retirer la solution secondaire de coloration des anticorps. Lavez les cellules trois fois avec du PBST puis centrifugez comme démontré précédemment.

Resuspendez les cellules dans le montant antifade. Pipettez la suspension cellulaire sur des lames de microscope et durcissez toute la nuit à température ambiante pour immobiliser les cellules. Le lendemain, ajoutez 100 microlitres de glycérol à 100 %.

Placez une barbe de couverture dessus et scellez-la avec du vernis à ongles. Placez la lame préparée sur la scène d’un microscope confocal. Dans l’interface logicielle du microscope, sélectionnez l’option Chemin de la lumière et réglez le réglage du séparateur de faisceau sur T90R10.

Ensuite, vérifiez les valeurs de longueur d’onde de coupure pour les miroirs dichroïques secondaires, ou SDM, dans le cadre Miroir. Dans le menu Détecteur, cliquez sur l’option Colorant et Sélection du détecteur pour assigner les canaux et longueurs d’onde d’excitation. Ensuite, réglez les valeurs de pourcentage d’intensité de puissance du laser pour chaque laser spécifique dans la plage de 10 à 15 %. Dans le menu Série, sous la section LSM, basculez l’option Z sur Activé. Réglez la taille de pas Z à l’optimum système de 0,74 micromètre.

Ensuite, dans le menu Section Z, saisissez la valeur du champ d’entrée de départ et définissez une pile Z basée sur le signal de membrane pour capturer le volume complet de la cellule. Dans le panneau Acquisition, saisissez le nom du fichier et l’emplacement de sauvegarde dans le champ d’entrée LSM. Et cliquez sur LSM Start pour lancer l’acquisition d’image.

Et sauvegardez les fichiers dans notre format microscope natif. Après acquisition, utilisez les flèches de navigation Z pour vérifier le signal et la distribution focale des différents colorants sur l’ensemble de la pile Z. Téléchargez le fichier sauvegardé dans Image J.In la fenêtre contextuelle Options d’importation des formats bio-formats, cliquez sur Ok.

Cliquez sur le menu Image pour ouvrir le fichier. Et dans les options déroulantes, sélectionnez Couleur, puis l’option Séparer les canaux pour ouvrir les différents canaux comme fenêtres séparées. Ensuite, ajustez le contraste de luminosité et optimisez les valeurs de LUT en utilisant l’option Ajuster dans le menu Image pour une visualisation améliorée de l’image.

Utilisez la barre de défilement de l’axe Z en bas de l’image pour parcourir les sections optiques et vérifier les caractéristiques cellulaires dans toute la pile. Dans le menu Image, choisissez Empiler. Ensuite, sélectionnez la fonction Z Project pour générer les projections d’intensité sommées de l’image confocale tridimensionnelle.

Dans la boîte de dialogue Projection Z, définissez les plages de tranche de début et d’arrêt. Sélectionnez le type de projection et cliquez sur Ok pour obtenir l’image composite 2D finale. Ensuite, allez dans le menu Image.

Sélectionnez l’option Type pour ajuster le type d’image à 16 bits. Ensuite, sauvegardez et exportez les images sous forme de fichiers TIF 16 bits. Importez les images enregistrées dans CellProfiler version 4.2.8 pour la segmentation automatisée des cellules, la quantification de l’intensité lumineuse réfléchie pour chaque cellule, et l’exportation des valeurs de mesure d’intensité dans un tableur.

Dans le tableur, définissez le seuil de positivité de la bêta-galactosidase associée à la sénescence comme la somme de l’intensité moyenne de la lumière réfléchie de la condition de pH 8 plus trois écarts-types. Classez les cellules en état de pH 6 comme béta-galactosidase associée à la sénescence si leurs valeurs d’intensité dépassent le seuil établi. La coloration par bêta-galactosidase associée à la sénescence à la lumière réfléchie des cellules SVF humaines a produit des motifs clairs et reproductibles sur trois niveaux de pH.

Au pH 5, la plupart des cellules montraient un signal fort en raison d’une forte activité enzymatique endogène. À la valeur standard du test de pH 6, l’intensité et la fréquence du signal diminuaient, permettant l’identification spécifique des cellules bêta-galactosidases associées à la sénescence. À pH 8, le signal était minimal, ce qui servait de référence pour définir le seuil de positivité.

Les tests de sensibilité à la détection ont montré que l’imagerie à lumière réfléchie surpassait Brightfield dans toutes les conditions de pH. Au pH 5, la lumière réfléchie montrait de forts précipités X-Gal, tandis que Brightfield ne captait que les plus grands dépôts. À pH 6, la lumière réfléchie a identifié des cellules positives trop faibles ou diffuses pour être vues dans le champ clair.

À pH 8, l’imagerie à lumière réfléchie a détecté un signal minimal, compatible avec une faible activité enzymatique, surpassant Brightfield dans l’identification des précipités X-Gal à des niveaux d’activité intermédiaires et inférieurs. Dans l’ensemble, ce flux de travail d’imagerie à lumière réfléchie intègre la détection simultanée de bêta-galactosidase associée à la sénescence dépendante du pH et de marqueurs basés sur la fluorescence, tels que CD31, facilitant ainsi des évaluations de sénescence multi-caractéristiques à résolution cellulaire unique au sein de populations hétérogènes de SVF. Ce protocole permet des mesures sensibles et quantitatives de l’activité SABG tout en tenant compte simultanément d’autres marqueurs de sénescence et d’autres marqueurs cellulaires.

Le principal défi, je dirais, est la configuration initiale de la microscopie. Mais une fois cela optimisé, vous pouvez utiliser les mêmes paramètres d’acquisition entre les expériences. Des études futures pourront combiner ce test avec d’autres marqueurs subcellulaires afin de voir comment la SABG se rapporte à différents processus cellulaires.