Marquage métabolique du transcriptome naissant chez Xenopus : embryogenèse précoce

Dans cette étude, nous étudions comment l’activation des gènes zygotiques et la régulation transitionnelle se produisent lors de la genèse précoce de l’embryon de xénopus. Les méthodes existantes peinent à détecter les nouveaux transcripts zygotiques activés qui émettent de nombreux ARN maternels. Ce protocole étiquette et enrichit les transcriptions naissantes.

Pour commencer, placez la chambre de microinjection sous un stéréoscopique et ajoutez un millilitre de solution Ficoll dans la chambre. Obtenez des embryons de Xenopus laevis stockés dans des ringers modifiés ou une solution MMR de 0,1X. Utilisez une pipette de transfert en plastique pour transférer 20 embryons ou plus au centre de la chambre de microinjection.

Préparez l’aiguille d’injection en coupant la fine pointe d’une aiguille en verre à la pince à épiler. Placez l’aiguille verticalement avec la pointe vers le bas et chargez 0,5 microlitre de 50 mM 5-éthynyluridine ou 5 M EU à l’aide d’une pipette P2 avec une pointe microchargeuse. Montez l’aiguille sur un micro-manipulateur.

À l’aide d’une pipette P10, placez 10 microlitres d’huile d’halocarbone sur un micromètre de scène placé sous un stéréomicroscope. Pour l’étalonnage du volume, appuyez sur la pédale du micro-injecteur et injectez une gouttelette dans l’huile d’halocarbure du micromètre. Ajustez la pression et le temps d’injection sur le micro-injecteur jusqu’à ce que le diamètre de la gouttelette atteigne 0,27 millimètre.

Tenir l’embryon de stade cellulaire à la pincette et contrôler l’aiguille avec le micromanipulateur pour injecter 10 nanolitres de 50 mM 5 EU. Transférez les embryons injectés dans un nouveau plat en verre contenant une solution de Ficoll et éclovez pendant une heure. Retirez la solution Ficoll et ajoutez une solution XMMR 0,1. Inspectez visuellement les embryons pendant le développement et retirez tout embryon anormal si nécessaire.

Transférez 10 embryons au stade de développement souhaité dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre. Retirez tout milieu résiduel du tube, congelez instantanément les embryons dans de l’azote liquide, puis conservez-les dans un congélateur à moins 80 degrés Celsius. Ensuite, extraire l’ARN total des embryons et mesurer sa concentration à l’aide de kits commerciaux.

Pour obtenir une réaction de clic de 50 microlitres, mélangez les composants présentés dans un tube microcentrifugeuse de 1,5 millilitre. Incubez le mélange de réaction sur un nutator à température ambiante pendant 30 minutes. Ajoutez maintenant du glycogène, de l’acétate d’ammonium et de l’éthanol refroidi à chaque mélange de réaction.

Bien mélanger en pipettant cinq fois. Incubez toute la nuit dans un congélateur à moins 80 degrés Celsius. Après une incubation nocturne, centrifugez à 13 000 g pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius, puis retirez le surnageant sans déranger le pellet.

Lavez le pellet deux fois avec 700 microlitres d’éthanol à 75 %. Après centrifugation et élimination du surnageant, laissez sécher la pastille à température ambiante à l’air pendant cinq à dix minutes puis resuspendez la pellete dans 10 microlitres d’eau sans RNase. Distribuez cinq microlitres de billes magnétiques enduites de streptavidine dans un nouveau tube de 1,5 millilitre.

Ajoutez neuf microlitres de tampon de lavage 2 aux billes et mélangez bien. Placez le tube sur un support magnétique pendant deux minutes. Retirez le surnageant et répétez les lavages deux fois de plus.

Ensuite, resuspendez les billes dans cinq microlitres de tampon de lavage 2. Préparez un mélange maître dans un tube microcentrifuge de 1,5 microlitre. Ajoutez 15 microlitres de mélange maître à chaque tube contenant l’échantillon d’ARN.

Placez le tube sur un bloc chauffant et faites couver-le à 69 degrés Celsius pendant cinq minutes. Ensuite, mettez le tube sur glace. Ensuite, ajoutez cinq microlitres de billes pré-lavées à chaque échantillon d’ARN, puis incubez sur un nutator à température ambiante pendant 30 minutes.

Lavez les complexes d’ARN billes cinq fois avec un tampon de lavage 1 de 50 microlitres, suivi de cinq lavages avec un tampon de lavage 2 de 50 microlitres. Resuspendez les billes dans un tampon de lavage de cinq microlitres 2. Utilisez directement les billes contenant les ARN EU naissants pour la synthèse complémentaire des acides désoxyribonucléique et la préparation de la bibliothèque.

Un nombre croissant de gènes activés différemment a été détecté lors de l’activation du génome zygotique lorsque le transcriptome naissant six heures après la fécondation a été comparé à celui à cinq heures après la fécondation, avec des augmentations supplémentaires observées sept heures après la fécondation, huit heures après la fécondation et neuf heures après la fécondation. Les gènes zygotiques ont été détectés à des niveaux plus élevés, et à des périodes plus précoces dans les données de séquençage ARN de l’UE naissantes comparées aux données totales de séquençage ARN. La purification soigneuse des ARN naissants métaboliquement marqués est le facteur le plus critique pour garantir la sensibilité et la spécificité de ce protocole.

Les ARN naissants marqués par l’UE produits selon ce protocole peuvent être analysés biochimiquement in vitro. Cette approche permet à de futures études d’étudier les schémas d’activation du génome, l’expression génique spécifique aux tissus et les mécanismes régulateurs sous forme de résolution unicellulaire.