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	<li>Hussein, R. S., Bin Dayel, S., Abahussein, O., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influences+on+skin+and+intrinsic+aging:+biological,+environmental,+and+therapeutic+insight.">Influences on skin and intrinsic aging: biological, environmental, and therapeutic insight.</a> J Cosmet Dermatol. 24, e16688 (2025).</li><li>Dorf, N., Maciejczyk, M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+senescence-from+basic+research+to+clinical+practice.">Skin senescence-from basic research to clinical practice.</a> Front Med (Lausanne). 11, 1484345 (2024).</li><li>Grenier, A., Morissette, M. C., Rochette, P. J., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+combination+of+cigarette+smoke+and+solar+rays+causes+effects+similar+to+skin+aging+in+a+bilayer+skin+model.">The combination of cigarette smoke and solar rays causes effects similar to skin aging in a bilayer skin model.</a> Sci Rep. 13, 17969 (2023).</li><li>Varani, J., Dame, M. K., Rittie, L., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+collagen+production+in+chronologically+aged+skin:+roles+of+age-dependent+alteration+in+fibroblast+function+and+defective+mechanical+stimulation.">Decreased collagen production in chronologically aged skin: roles of age-dependent alteration in fibroblast function and defective mechanical stimulation.</a> Am J Pathol. 168, 1861-1868 (2006).</li><li>Zhang, S., Duan, E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fighting+against+skin+aging:+the+way+from+bench+to+bedside.">Fighting against skin aging: the way from bench to bedside.</a> Cell Transplant. 27, 729-738 (2018).</li><li>Hussen, N. H. a., Abdulla, S. K., Ali, N. M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+antioxidants+in+skin+aging+and+the+molecular+mechanism+of+ROS:+a+comprehensive+review.">Role of antioxidants in skin aging and the molecular mechanism of ROS: a comprehensive review.</a> Aspects Mol Med. 5, 100063 (2025).</li><li>Addor, F. A. S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+photoaging:+additional+factors+involved+in+the+process+of+skin+aging.">Beyond photoaging: additional factors involved in the process of skin aging.</a> Clin Cosmet Investig Dermatol. 11, 437-443 (2018).</li><li>Mucha, M., Skrzydlewska, E., GÄ™gotek, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+protection+against+oxidative+stress+in+human+skin+melanocytes.">Natural protection against oxidative stress in human skin melanocytes.</a> Commun Biol. 8, 1283 (2025).</li><li>Hughes, B. K., Bishop, C. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+understanding+of+the+role+of+senescent+melanocytes+in+skin+ageing.">Current understanding of the role of senescent melanocytes in skin ageing.</a> Biomedicines. 10, 3111 (2022).</li><li>Kami&#324;ski, K., Kazimierczak, U., Kolenda, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+in+melanogenesis+and+melanoma+development.">Oxidative stress in melanogenesis and melanoma development.</a> Contemp Oncol (Pozn). 26, 1-7 (2022).</li><li>Jim&#233;nez-Cervantes, C., Mart&#237;nez-Esparza, M., P&#233;rez, C., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+melanogenesis+in+response+to+oxidative+stress:+transient+downregulation+of+melanocyte+differentiation+markers+and+possible+involvement+of+microphthalmia+transcription+factor.">Inhibition of melanogenesis in response to oxidative stress: transient downregulation of melanocyte differentiation markers and possible involvement of microphthalmia transcription factor.</a> J Cell Sci. 114, 2335-2344 (2001).</li><li>Da&#324;czak-Pazdrowska, A., Gornowicz-Porowska, J., Pola&#324;ska, A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+senescence+in+skin-related+research:+targeted+signaling+pathways+and+naturally+occurring+therapeutic+agents.">Cellular senescence in skin-related research: targeted signaling pathways and naturally occurring therapeutic agents.</a> Aging Cell. 22, e13845 (2023).</li><li>Green, K. J., Pokorny, J., Jarrell, B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dangerous+liaisons:+loss+of+keratinocyte+control+over+melanocytes+in+melanomagenesis.">Dangerous liaisons: loss of keratinocyte control over melanocytes in melanomagenesis.</a> Bioessays. 46, e2400135 (2024).</li><li>Ali, L., Al Niaimi, F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+melasma+explained.">Pathogenesis of melasma explained.</a> Int J Dermatol. 64, 1201-1212 (2025).</li><li>Low, E., Alimohammadiha, G., Smith, L. A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+good+is+the+evidence+that+cellular+senescence+causes+skin+ageing.">How good is the evidence that cellular senescence causes skin ageing.</a> Ageing Res Rev. 71, 101456 (2021).</li><li>Chin, T., Lee, X. E., Ng, P. Y., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+cellular+senescence+in+skin+aging+and+age-related+skin+pathologies.">The role of cellular senescence in skin aging and age-related skin pathologies.</a> Front Physiol. 14, 1297637 (2023).</li><li>Gerasymchuk, M., Robinson, G. I., Kovalchuk, O., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+of+the+senescence-associated+phenotype+in+human+skin+fibroblasts.">Modeling of the senescence-associated phenotype in human skin fibroblasts.</a> Int J Mol Sci. 23, 7124 (2022).</li><li>Zimmermann, T., Pommer, M., Kluge, V., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+cellular+senescence+in+human+primary+melanocytes+and+malignant+melanoma+cells+in+vitro.">Detection of cellular senescence in human primary melanocytes and malignant melanoma cells in vitro.</a> Cells. 11, 1489 (2022).</li><li>Tang, J., Li, Q., Cheng, B., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+culture+of+human+face+skin+melanocytes+for+the+study+of+hyperpigmentation.">Primary culture of human face skin melanocytes for the study of hyperpigmentation.</a> Cytotechnology. 66, 891-898 (2014).</li><li>Ku&#269;era, O., Endlicher, R., Rou&#353;ar, T., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+tert-butyl+hydroperoxide-induced+oxidative+stress+on+lean+and+steatotic+rat+hepatocytes+in+vitro.">The effect of tert-butyl hydroperoxide-induced oxidative stress on lean and steatotic rat hepatocytes in vitro.</a> Oxid Med Cell Longev. 2014, 752506 (2014).</li><li>Wedel, S., Martic, I., Hrapovic, N., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=tBHP+treatment+as+a+model+for+cellular+senescence+and+pollution-induced+skin+aging.">tBHP treatment as a model for cellular senescence and pollution-induced skin aging.</a> Mech Ageing Dev. 190, 111318 (2020).</li><li>Rabin, D. M., Rabin, R. L., Blenkinsop, T. A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+oxidative+stress+upregulates+drusen-related+protein+expression+in+adult+human+RPE+stem+cell-derived+RPE+cells:+a+novel+culture+model+for+dry+AMD.">Chronic oxidative stress upregulates drusen-related protein expression in adult human RPE stem cell-derived RPE cells: a novel culture model for dry AMD.</a> Aging (Albany NY). 5, 51-66 (2013).</li><li>Shakel, Z., Costa Lima, S. A., Reis, S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+to+make+human+skin+models+based+on+cellular+senescence+for+ageing+research.">Strategies to make human skin models based on cellular senescence for ageing research.</a> Ageing Res Rev. 100, 102430 (2024).</li><li>Mort, R. L., Jackson, I. J., Patton, E. E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+melanocyte+lineage+in+development+and+disease.">The melanocyte lineage in development and disease.</a> Development. 142, 620-632 (2015).</li><li>Goff, P. S., Castle, J. T., Kohli, J. S., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+transfection+of+melanocytes.">Isolation, culture, and transfection of melanocytes.</a> Curr Protoc. 3, e774 (2023).</li><li>Martic, I., Wedel, S., Jansen-DÃ¼rr, P., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+model+to+investigate+UVB-induced+cellular+senescence+and+pigmentation+in+melanocytes.">A new model to investigate UVB-induced cellular senescence and pigmentation in melanocytes.</a> Mech Ageing Dev. 190, 111322 (2020).</li><li>Victorelli, S., Lagnado, A., Halim, J., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescent+human+melanocytes+drive+skin+ageing+via+paracrine+telomere+dysfunction.">Senescent human melanocytes drive skin ageing via paracrine telomere dysfunction.</a> EMBO J. 38, e101982 (2019).</li><li>Zhang, H., Davies, K. J. A., Forman, H. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+response+and+Nrf2+signaling+in+aging.">Oxidative stress response and Nrf2 signaling in aging.</a> Free Radic Biol Med. 88, 314-336 (2015).</li><li>Birch, J., Gil, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescence+and+the+SASP:+many+therapeutic+avenues.">Senescence and the SASP: many therapeutic avenues.</a> Genes Dev. 34, 1565-1576 (2020).</li><li>Kang, H. Y., Ortonne, J. P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+should+be+considered+in+treatment+of+melasma.">What should be considered in treatment of melasma.</a> Ann Dermatol. 22, 373-378 (2010).</li><li>Davalli, P., Mitic, T., Caporali, A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS,+cell+senescence,+and+novel+molecular+mechanisms+in+aging+and+age-related+diseases.">ROS, cell senescence, and novel molecular mechanisms in aging and age-related diseases.</a> Oxid Med Cell Longev. 2016, 3565127 (2016).</li><li>Almeida, F. V., Douglass, S. M., Fane, M. E., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bad+company:+microenvironmentally+mediated+resistance+to+targeted+therapy+in+melanoma.">Bad company: microenvironmentally mediated resistance to targeted therapy in melanoma.</a> Pigment Cell Melanoma Res. 32, 237-247 (2019).</li><li>Brenner, M., Hearing, V. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protective+role+of+melanin+against+UV+damage+in+human+skin.">The protective role of melanin against UV damage in human skin.</a> Photochem Photobiol. 84, 539-549 (2008).</li><li>L&#243;pez-Ot&#237;n, C., Blasco, M. A., Partridge, L., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hallmarks+of+aging.">The hallmarks of aging.</a> Cell. 153, 1194-1217 (2013).</li><li>Videira, I. F., Moura, D. F., Magina, S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+regulating+melanogenesis.">Mechanisms regulating melanogenesis.</a> An Bras Dermatol. 88, 76-83 (2013).</li><li>Ratz-&#321;yko, A., Arct, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resveratrol+as+an+active+ingredient+for+cosmetic+and+dermatological+applications:+a+review.">Resveratrol as an active ingredient for cosmetic and dermatological applications: a review.</a> J Cosmet Laser Ther. 21, 84-90 (2019).</li><li>Xu, M., Pirtskhalava, T., Farr, J. N., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senolytics+improve+physical+function+and+increase+lifespan+in+old+age.">Senolytics improve physical function and increase lifespan in old age.</a> Nat Med. 24, 1246-1256 (2018).</li><li>Ogrodnik, M., Evans, S. A., Fielder, E., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+senescent+cell+clearance+alleviates+age-related+brain+inflammation+and+cognitive+impairment+in+mice.">Whole-body senescent cell clearance alleviates age-related brain inflammation and cognitive impairment in mice.</a> Aging Cell. 20, e13296 (2021).</li><li>Hernandez-Segura, A., de Jong, T. V., Melov, S., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unmasking+transcriptional+heterogeneity+in+senescent+cells.">Unmasking transcriptional heterogeneity in senescent cells.</a> Curr Biol. 27, 2652-2660.e4 (2017).</li></ol>

<table><tbody><tr><td>0,22 &micro;m filtre à membrane</td><td>Merck&nbsp;</td><td>SLGVR33RS</td><td></td></tr><tr><td>1 M acide citrique&nbsp;</td><td>Merck&nbsp;</td><td>K91567844</td><td>préparer dans aq. dest.</td></tr><tr><td>1 M MgCl2</td><td>Merck</td><td>A649033</td><td>préparer dans aq. dest.</td></tr><tr><td>1 M Na2HPO4</td><td>Merck</td><td>K56036736</td><td>préparer dans aq. dest.</td></tr><tr><td>10 M NaOH</td><td>Lab Honeywell</td><td>30620</td><td>préparer dans aq. dest.</td></tr><tr><td>37% formaldéhyde</td><td>Sigma</td><td>252549</td><td></td></tr><tr><td>4% paraformaldéhyde</td><td>CarlRoth</td><td>0335.3</td><td></td></tr><tr><td>5 M Chlorure de sodium&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td>préparer dans aq. dest.</td></tr><tr><td>50% glutaraldéhyde</td><td>Sigma</td><td>G6403</td><td></td></tr><tr><td>5-Brom-4-Chlor-3-indolyl-&beta;-D-Galactopyranosid (X-Gal)</td><td>Sigma</td><td>B9146</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps secondaire conjugué à Alexa Fluor 2 mg/mL</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>BSA (albumine sérique bovine)</td><td>Sigma</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Substrat chimiluminescent</td><td>Sigma</td><td>WBKLS0500</td><td></td></tr><tr><td>Costar CellLifter&nbsp;</td><td>Corning</td><td>3008</td><td></td></tr><tr><td>Lamelles pour culture cellulaire/microscopie</td><td>Epredia</td><td>CB00200RA120MNZ0</td><td></td></tr><tr><td>DermaLife Medium de base</td><td>CellSystems</td><td>LM-0004</td><td></td></tr><tr><td>Kit DermaLife M pour mélanocytes&nbsp;</td><td>CellSystems</td><td>LS-1041</td><td></td></tr><tr><td>Tampon phosphate de Dulbecco tamponné&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Mélanocytes néonatals humains</td><td>CellSystems</td><td>FC-0023</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps LaminB1 (lapin)</td><td>Abcam</td><td>AB16048</td><td>Dilution 1:1000 dans 5% BSA</td></tr><tr><td>Milieu de montage contenant du DAPI</td><td>Abcam</td><td>AB104139</td><td></td></tr><tr><td>Solution de pénicilline-streptomycine&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Géis de gradient de polyacrylamide</td><td>Bio-Rad</td><td>456-8095</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine, 0,1 mg/mL&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>A38904-01</td><td></td></tr><tr><td>Ferricien de potassium</td><td>Sigma</td><td>P8131</td><td></td></tr><tr><td>Ferrocyanure de potassium</td><td>Sigma</td><td>P-9387</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps pRB (lapin)</td><td>CellSignalling</td><td>93085</td><td>Dilution 1:1000 dans 5% BSA</td></tr><tr><td>Cocktail d'inhibiteurs de protéase</td><td>préparé par nous</td><td>N/A</td><td>500 mM NaF; 2 &micro;g/ml Aprotinine; 1 mM PMSF; 1 mM Na-Orthovanadate activé</td></tr><tr><td>Tampon RIPA&nbsp;</td><td>préparé par nous</td><td>N/A</td><td>contenant: 50 mM Tris-HCl; 1% NP-40; 0,5% Na-désoxycholate; 0,1% SDS; 150 mM NaCl; 2 mM EDTA</td></tr><tr><td>Tampon RLT</td><td>Qiagen</td><td>1015762</td><td>Inclus dans le kit RNeasy Mini&nbsp;</td></tr><tr><td>Kit RNeasy Mini</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td></td></tr><tr><td>Poudre de lait écrémé (pour 5% de lait dans TBS-T)</td><td>Sigma</td><td>70166</td><td></td></tr><tr><td>Citrate de sodium (pour une solution à 0,1%)</td><td>Sigma</td><td>S4641</td><td></td></tr><tr><td>Inhibiteur de trypsine de soja, 0,5 mg/mL&nbsp;</td><td>Thermofisher</td><td>17075-029</td><td></td></tr><tr><td>tert-Butyl hydroperoxyde (tBHP)</td><td>Sigma</td><td>458139</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 (pour une solution à 0,3%)</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Solution trypsine-EDTA</td><td>Sigma</td><td>T3924</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoéthanol</td><td>CarlRoth</td><td>4227.3</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps &gamma;H2AX (lapin)</td><td>CellSignalling</td><td>2577S</td><td>Dilution 1:200&nbsp;</td></tr></tbody></table>

un protocole standardisé pour induire la sénescence prématurée induite par le stress chez les mélanocytes humains primaires à l’aide de tert-butyl hydroperoxyde

A Standardized Protocol for Inducing Stress-Induced Premature Senescence in Primary Human Melanocytes Using Tert-butyl Hydroperoxide

Un protocole standardisé pour induire la sénescence prématurée induite par le stress chez les mélanocytes humains primaires à l’aide de tert-butyl hydroperoxyde

Environmental stressors, including UV radiation, air pollution, or cigarette smoke, drive extrinsic skin aging. Exposure to these extrinsic aging factors ...

Notre recherche se concentre sur l'étude du phénotype de sénescence des mélanocytes et de sa contribution au vieillissement cutané extrinsèque. Les modèles établis de sénescence utilisent des fibroblastes et ne parviennent pas à rendre compte de la biologie propre aux mélanocytes. Ce protocole induit un stress oxydatif médié par le tBHP dans des mélanocytes humains primaires.Pour commencer, rassemblez les réactifs nécessaires. Après avoir décongelé les mélanocytes et leur avoir permis de se rétablir pendant trois jours, assurez-vous que les cellules atteignent une confluence de 80 à 90 % le jour du semis. Aspirez le milieu du flacon.Lavez les cellules deux fois avec du DPBS. Ajoutez deux millilitres de solution de trypsine-EDTA pour détacher les cellules. Placez le flacon dans l’incubateur pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone.Tapotez doucement le flacon. Puis, au microscope, observez les cellules afin de confirmer un détachement complet. Ajoutez un volume équivalent à 1,5 fois celui de l'inhibiteur de trypsine pour arrêter la réaction.Transférez la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 millilitres. Diluez la suspension avec du DPBS jusqu'à un volume final de 10 millilitres. Effectuez une centrifugation de la suspension cellulaire à une force centrifuge relative de 100 pendant cinq minutes.Aspirez le surnageant et resuspendez le culot cellulaire dans du milieu jusqu'au volume désiré. Semez 600 000 cellules par boîte de 10 centimètres pour les plaques traitées au tert-butyl hydroperoxyde, ou tBHP. Semez 400 000 cellules par plaque pour les plaques témoins.Préparez une solution de travail de 10 millimolaire à partir du stock de tBHP en utilisant du DPBS ou du milieu. Ajoutez 100 micromolaire de tBHP aux cellules pendant une heure par traitement. Déplacez la plaque d'avant en arrière pour répartir uniformément le tBHP dans tout le milieu.Placer les cellules dans l'incubateur exactement une heure à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone. Aspirer le milieu pour interrompre le traitement par le tBHP. Laver les plaques deux fois avec du DPBS préchauffé à 37 degrés Celsius.Ajoutez le volume approprié de milieu frais dans les plaques. Placez les plaques dans l'incubateur et laissez les cellules se rétablir pendant au moins quatre heures avant le prochain traitement. Répétez la procédure de traitement plus tard le même jour pour le deuxième traitement.Poursuivez le traitement jusqu'au jour quatre, puis maintenez les cellules en culture jusqu'au jour neuf afin d'évaluer les marqueurs de sénescence. Comptez les cellules traitées au tBHP et les cellules témoins. Repiquez-les à la même densité initiale, ou si moins de 600 000 cellules sont obtenues à partir des plaques traitées au tBHP, repiquez toutes les cellules collectées.Compter les cellules aux jours quatre, neuf et quinze de la culture. Au jour neuf, laver les cellules deux fois avec du PBS. Fixer les cellules à l'aide de formaldéhyde à 2 % et de glutaraldéhyde à 0,4 %.Lavez les cellules fixées deux fois avec du PBS. Incubez les cellules fixées dans une solution de coloration à pH 6. Couvrez la plaque pour la protéger de la lumière, puis incubez-la pendant 18 heures à 37 degrés Celsius en l'absence de dioxyde de carbone.Lavez les cellules deux fois avec du PBS. À l’aide d’une microscopie en lumière, observez et comptez le nombre de cellules colorées en bleu. Divisez ce nombre par le nombre total de cellules dans le même champ.Exprimez les résultats en pourcentage de cellules positives. Après l'induction du stress oxydatif, le traitement par le tBHP a réduit de manière significative la prolifération des mélanocytes par rapport aux témoins. Les cellules traitées ont atteint seulement 1,4 doublement cumulatif de la population, ou cPDL, au neuvième jour, tandis que les témoins ont atteint 3,1 cPDL.Vers le jour 15, les cellules traitées atteignaient un plateau à 1,9 cPDL, tandis que les cellules témoins se développaient jusqu'à 5,1 cPDL. Les mélanocytes traités au tBHP présentaient une augmentation de la surface cellulaire par rapport aux témoins à tous les points temporels mesurés, l'élargissement progressant jusqu'au jour 15, ce qui est conforme à la morphologie élargie et aplatie des cellules sénescentes. Les mélanocytes traités au tBHP montraient une augmentation de l'activité de la bêta-galactosidase associée à la sénescence, ou activité SA-bêta-galactosidase, avec 32 % de cellules positives contre 3 % chez les témoins.L'augmentation de la positivité à la SA-bêta-galactosidase était conforme à un phénotype sénescen. Une analyse par immunofluorescence a montré une augmentation des niveaux de gamma-H2AX dans les mélanocytes traités au tBHP par rapport aux témoins. Les cellules traitées présentaient un signal gamma-H2AX plus intense que les témoins.L'analyse par réaction en chaîne par polymérase quantitative en temps réel a démontré une augmentation de l'expression des facteurs du phénotype sécréteur associé au vieillissement, l'interleukine-8 présentant l'augmentation la plus importante, tandis que l'interleukine-6 et la métalloprotéinase matricielle-1 ont montré des augmentations modérées. L'analyse par immunotransfert a confirmé l'induction du vieillissement cellulaire.La laminine B1 a montré une réduction significative dans les mélanocytes traités au tBHP par rapport aux témoins. Les niveaux de la protéine du rétinoblastome phosphorylée étaient réduits dans les mélanocytes traités au tBHP par rapport aux contrôles. Le traitement au tBHP a augmenté l'expression transcriptionnelle de p16 et de p21 dans les mélanocytes.Ce modèle permet aux chercheurs d'étudier comment les mélanocytes sénescents affectent la pigmentation et communiquent avec les cellules environnantes via des facteurs inflammatoires SASP. La difficulté de ce protocole réside dans le respect précis du calendrier. Le tBHP doit être appliqué deux fois par jour avec un intervalle d'au moins quatre heures.Suite à ce protocole, la sénescence peut être caractérisée à l'aide de la coloration par la bêta-galactosidase associée à la sénescence, de l'immunofluorescence, de la RT-qPCR et du Western blotting dirigé contre des marqueurs établis de la sénescence.

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