Caractérisation de la structure et de la fonction membranaire lipide-protéine à l’aide de bicouches d’interface de gouttelettes

Dans ce travail, nous étudions comment les propriétés physiques et électriques des membranes lipidiques et de leur environnement influencent la conduction ionique dans les systèmes modèles bicouches à interface de gouttelettes. L’électrophysiologie traditionnelle par clamp patch ne sonde pas la biophysique membranaire à plus grande échelle, mais cette plateforme unique capture à la fois l’activité à canal unique et les surfaces membranaires plus grandes à l’échelle millimétrique afin d’étudier plus en profondeur la biophysique membranaire. Pour commencer, préparez les électrodes en fil d’argent chloré recouvertes d’agarose et les solutions de vésicules lipidiques pour des expériences électrophysiologiques.

Pour la formation de bicouches d’interface de gouttelettes, placez une boîte de Petri transparente au fond sur l’étage d’un microscope inversé. Remplissez le plat d’huile d’alcane comme 100 % d’hexadécane jusqu’à une profondeur d’environ cinq millimètres. Après avoir fixé les électrodes à la tête de la bouche à pince et au support d’électrode à terre, utilisez les commandes du micromanipulateur pour descendre les deux extrémités à billes recouvertes d’agarose dans l’huile à une profondeur d’environ 2,5 millimètres sous la surface de l’huile, évitant les mouvements rapides pour éviter les collisions avec la boîte de Petri.

Ajustez la mise au point du microscope jusqu’à ce que les deux extrémités de la boule et leurs revêtements en agarose soient nettement nettes. Placez les électrodes près du bord du champ de vision, afin que les deux puissent être observées simultanément. À l’aide d’une pipette calibrée de deux microlitres, aspirez les vésicules lipidiques DPhPC extrudées dopées à la gramicidine A. Distribuez lentement 250 nanolitres de la suspension directement sur chaque extrémité à boule recouverte d’agarose en utilisant une pointe de pipette séparée pour chacune sans toucher la coquille d’agarose.

Laissez les gouttelettes se répandre sur la surface de l’agarose et s’affaisser visiblement vers le bas à cause de la gravité et de la réduction de la tension superficielle, formant une forme de gouttelette pendante. Observez l’affaissement de côté à travers la paroi de la boîte de Petri si c’est dégagé. Après cinq minutes, poussez doucement la table anti-vibration pour évaluer la gouttelette.

Confirmez que les gouttelettes affaissées se déplacent avec un léger délai par rapport au mouvement des électrodes, indiquant la formation de gouttelettes monocouches lipidiques entièrement recouvertes. Si ce comportement n’est pas observé, attendez deux à trois minutes supplémentaires et répétez l’évaluation. Assurez-vous que le microscope, la table anti-vibrations, la cage de Faraday, l’amplificateur, le numériseur, le générateur de fonctions et l’ordinateur sont connectés à une mise à la terre commune.

Organiser les connexions de l’instrument selon le guide de réglage du fabricant et configurer l’installation électrique et optique essentielle, en suivant les instructions détaillées pour les expériences sur l’interface à gouttelettes bicouches. Configurez un générateur de fonctions externe ou le canal de sortie logiciel d’acquisition pour générer une forme d’onde de tension triangulaire de 10 Hertz et 10 millivolts. Confirmez l’amplitude et la fréquence sur un oscilloscope connecté et dans le logiciel d’acquisition.

Après que les gouttelettes se sont affaissées pendant environ 10 minutes, utilisez les micromanipulateurs pour les amener en contact délicat. Activez la forme d’onde triangulaire de 10 Hertz et 10 millivolts et surveillez la réponse capacitive au courant dans le logiciel d’acquisition. Ajustez la surface de contact des gouttelettes en déplaçant légèrement les électrodes jusqu’à ce que la réponse du courant capacitif pic à pic à la forme d’onde soit comprise entre environ 100 et 200 picoampères.

Ou bien la surface de contact ne dépasse pas environ un quart du diamètre de la gouttelette. Attendre la formation spontanée de deux couches indiquée électriquement par une réponse capacitive en expansion de pic à pic et optiquement par une réflexion interne croissante avec une apparence ovale à la région de contact. Confirmer que les bicouches lipidiques pures présentent des plateaux rectangulaires de courant en réponse au stimulus de tension triangulaire, tandis que les bicouches dopées à la gramicidine A présentent des plateaux inclinés, reflétant une conduction ionique d’ensemble.

Une fois les réponses stables-capacitives ou conductrices confirmées, désactivez la forme d’onde triangulaire et laissez la bicouche d’interface gouttelette s’équilibrer pendant au moins 15 minutes avant d’appliquer les protocoles de stimulation. Dans le logiciel de capture vidéo, réglez le taux d’images par seconde à au moins 20 images par seconde. Sélectionnez les réglages appropriés de l’appareil photo et de l’objectif objectif.

Ensuite, cliquez sur Acquérir et sélectionnez Nouveau protocole. Dans l’onglet Mode acquisition, sélectionnez Stimulation épisodique. Fixez les runs par essai et les balayages par run à un.

Ajustez la durée du balayage à quatre secondes de plus que la durée totale de l’expérimentation, permettant une base de deux secondes avant et après le stimulus. Réglez la fréquence d’échantillonnage entre cinq et dix kilohertz. Dans l’onglet Entrées, assignez le canal d’enregistrement à l’entrée actuelle.

Puis, dans l’onglet Sorties, assignez le canal de stimulation à la sortie de tension contrôlant les électrodes. Ouvre l’onglet Forme d’onde. Dans la colonne A, réglez le type à Étape, le premier niveau et le niveau delta à zéro millivolt, et la première durée à 2 000 millisecondes pour définir une base de pré-stimulation.

Dans la colonne B, définissez le type Pulse pour faciliter la présence d’impulsions par paires. Spécifier les valeurs pour la première durée et l’amplitude de tension de premier niveau, puis définir le débit de train pour définir l’intervalle d’interimpulsions correspondant au cycle de travail cible. Ajustez la largeur d’impulsion à 100 millisecondes.

Dans la colonne C, pour la dépression d’impulsion appariée, réglez le type sur Impulsion avec la même amplitude et durée d’impulsion. Régler le taux de train pour obtenir le cycle de service plus bas souhaité et régler la largeur d’impulsion. Ensuite, dans la colonne D, configurez les paramètres post-stimulation identiques à la base pré-stimulation.

Examinez le protocole et enregistrez-le avec un nom descriptif. Commencez l’enregistrement vidéo et lancez immédiatement l’acquisition et la stimulation électriques en cliquant sur le bouton Enregistrer dans chaque logiciel. Pendant les 60 premières secondes de stimulation, observez que le courant augmente et peut atteindre un plateau.

Au cours des 60 dernières secondes, observez que le courant diminue. À la fin du protocole, arrêtez simultanément l’acquisition électrique et l’enregistrement vidéo. Enfin, effectuez un post-traitement pour extraire la surface de membrane et calculer le courant, la surface et le flux normalisés à partir des données d’imagerie et électriques.

Des images séquentielles ont capturé des éclairs spontanés en bicouche et une expansion de la surface lorsque deux gouttelettes affaissées étaient en contact. Les réflexions ovales internes brillantes au contact des gouttelettes ont été utilisées pour estimer le diamètre de la bicouche et la surface de la membrane au fil du temps. La facilitation par impulsions appariées de zéro seconde à 60 secondes et la dépression d’impulsions appariées de 60 secondes à 120 secondes ont été délivrées à l’aide d’impulsions de 100 millisecondes.

Les réponses actuelles représentatives pendant les règles et les schémas de stimulation ont été enregistrés. Le courant normalisé pour les bicouches DPhPC dopées à la gramocydine A dans les huiles hexadécane et dodécane/hexadécane est observé lors de la facilitation par impulsions par paires et de la dépression des impulsions par paires. La surface membraneuse normalisée mesurée à 30 points temporels a montré une évolution similaire de la surface dans les deux conditions pétrolières malgré des courants différents.

Le flux normalisé a séparé les changements de conductance indépendants de la surface et était cohérent avec des changements de conduction membranaire au-delà de la simple expansion de surface. Une stimulation prolongée par dépression pulsaire pendant jusqu’à 30 minutes a produit un comportement prolongé de type dépression dans les membranes hexadécane, mais a maintenu un flux élevé dans les membranes dodécane/hexadécane cohérent avec un comportement de potentialisation à long terme. Ce protocole nous permet de mesurer comment la structure membranaire et la conduction ionique évoluent grâce à une restructuration électrique des bicouches d’interface de gouttelettes.

Cette plateforme peut supporter de nombreux protocoles de stimulation différents en dibs avec des canaux ioniques, sans canaux ioniques, et même des canaux photoisomérisables pour mieux sonder la dynamique des membranes et les propriétés électriques. Parce que cette plateforme accordable sonde à la fois la biophysique membranaire à l’échelle macroscale et à l’échelle microscale, les expérimentations futures s’amélioreraient considérablement en utilisant la spectroscopie de fluorescence pour séparer plus en toute confiance l’activité des canaux protéiques de la conduction des pores membranaires.