Dispositif millifluidique en culture continue pour l’étude d’Escherichia coli dans des conditions nutritives faibles et fluctuantes

Mes recherches portent sur l’étude de la façon dont les bactéries s’adaptent physiologiquement à des conditions nutritives faibles et fluctuantes typiques des environnements naturels. Les systèmes de culture conventionnels reproduisent mal les conditions de faible dynamique nutritive, alors que notre système permet la culture dans ces conditions environnementales pertinentes. Préparez la culture nocturne la veille de l’expérience.

Préparez une pré-culture en ajoutant six microlitres de la culture nocturne à un tube contenant six millilitres de milieux définis complets riches, ou RDM. Divisez le mélange également en deux tubes de culture de 15 millilitres et étiquetez-les comme A et B. Incubez les deux tubes à 37 degrés Celsius, en secouant à 200 tr/min. Surveillez la densité optique à 600 nanomètres à l’aide du tube B, et ne procédez pas tant que la densité optique n’a pas atteint environ 0,5.

Pendant l’incubation, préparez le milieu à faible RDM et allouez le volume total entre les bouteilles selon les moments précis. Ensuite, scellez chaque bouteille avec des bouchons équipés de trois tubes. Connectez le troisième tube en silicone le plus large à un filtre de ventilation de 0,2 micromètre pour un échange d’air stérile.

Fixez une extrémité de chaque tube péristaltique, équipée de connecteurs Luer mâles, aux tubes en silicone de plus petit diamètre. Laissez le couvercle en aluminium sur le raccord de verrouillage Luer mâle libre à l’autre extrémité des tubes péristaltiques jusqu’au début de l’expérience afin d’éviter toute contamination. Placez les bouteilles et la pompe péristaltique dans un incubateur réglé à 37 degrés Celsius.

Fixez tous les tuyaux péristaltiques dans les canaux de la même tête de pompe, en garantissant des débits identiques sur tous les filtres. Diluez la pré-culture à un ratio de un pour dix en ajoutant 600 microlitres de culture dans un tube contenant 5,4 millilitres de Low RDM. À l’aide d’une pipette d’un millilitre, introduisez un millilitre de culture diluée dans chacun des six filtres de polyvinylidène fluorure de 0,45 micromètre, ou PVDF.

Après avoir rincé les clapets anti-retour unidirectionnels avec de l’eau ultra-pure autoclavée, fixez-les à chaque extrémité des filtres. Retirez les couvercles en aluminium des raccords de tubes. Reliez chaque filtre aux raccords du tuyau péristaltique.

Réglez le débit à deux millilitres par minute sur la pompe péristaltique. Placez un récipient à déchets sous les filtres pour collecter les sorties, puis démarrez le débit. Après deux heures, débranchez un des filtres reliés à la bouteille d’un litre, dévissez les clapets anti-retour unidirectionnels, et placez le filtre dans un tube centrifugeuse de 50 millilitres avec l’entrée orientée vers le bas.

Centrifugez à 2 000 G pendant deux minutes. À l’aide d’un coupe-pipe stérilisé, appliquez une pression douce à l’extrémité de sortie du boîtier en plastique pour ouvrir le filtre. Relâchez le cylindre intérieur et jetez la section contenant la membrane.

Rincez les parois internes du tubage filtrant avec le milieu de culture collecté. Mesurez le volume total collecté à l’aide d’une pipette sérologique de cinq millilitres. Prenez trois aliquotes de 100 microlitres de l’échantillon et fixez-les avec du glutaraldéhyde jusqu’à une concentration finale de 1,5 %. Débranchez les filtres correspondants aux moments suivants et répétez la procédure de collecte.

Étiquetez les échantillons collectés selon leurs moments respectifs. Marquez les échantillons avec le colorant d’ADN fluorescent et comptez les cellules à l’aide de la cytométrie en flux. Au fil du temps, les 10 logaritmies des décomptes de cellules transformées ont suivi des trajectoires linéaires, indiquant une croissance exponentielle dans toutes les conditions.

Les taux de croissance étaient d’environ 0,88 par heure pour la condition de 0,5 % de GDR, de 0,64 par heure pour la condition de 0,25 %, et de 0,18 par heure pour la condition de 0,01 %. Le nombre de cellules a atteint jusqu’à un milliard de cellules par échantillon, démontrant que le dispositif de culture millifluidique continue, ou MCCD, soutient à la fois une croissance exponentielle et un rendement élevé en biomasse à des concentrations de nutriments nanomolaires à micromolaires. Les cellules cultivées à 0,5 % de RDM avaient une longueur moyenne de cellule supérieure à celles cultivées à 0,01 % de RDM.

Le principal défi lors de la culture à faible teneur en nutriments est de maintenir une densité cellulaire adéquate pour éviter l’obstruction, l’accumulation de pression et l’épuisement des nutriments. Suite à cette procédure, les cellules peuvent être prélevées pour d’autres analyses en aval, notamment en protéomique, métabolomique et d’autres approches omiques. Des études futures pourront étudier l’adaptation microbienne aux limitations et fluctuations des nutriments en intégrant ce protocole à une analyse omiquement quantitative.