Profilage lysosomal avec LysoTracker pour une évaluation quantitative de la sénescence cellulaire chez les fibroblastes humains

Nous étudions la sénescence cellulaire et sa caractérisation, en nous concentrant sur la manière dont des caractéristiques comme les changements lysosomais peuvent servir de marqueurs de sénescence. Les marqueurs de sénescence conventionnels sont souvent basés sur le point final et binaires, tandis que l’imagerie en cellules vivantes peut lire la sénescence comme un signal quantitatif continu à travers les conditions. Pour commencer, semez les fibroblastes IMR-90 dans une plaque à 24 puits et incubez-les à 37 degrés Celsius dans un incubateur à 5 % de dioxyde de carbone jusqu’à former une monocouche subconfluente.

Notez la densité de semis et le temps entre le placage et la coloration lysosomale pour chaque expérience. Réchauffez le milieu de culture complet à 37 degrés Celsius. Préparez une solution de travail LysoTracker Deep Red à 75 nanomolaires dans le substrat, et protégez-la de la lumière.

Mélangez la solution de travail par inversion douce. Sélectionnez des cohortes de fibroblastes IMR-90 pré-sénescentes et sénécentes appariées, préparées selon une méthode d’induction par sénescence définie. Confirmez le phénotype sénescent en surveillant les caractéristiques de croissance et la morphologie.

Aspirez le milieu utilisé de chaque puits. Ajoutez doucement la solution de travail LysoTracker le long de la paroi de chaque puits, évitant ainsi toute perturbation de la monocouche. Incubez les cellules avec LysoTracker pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius dans un incubateur à 5 % de dioxyde de carbone.

Durant les 10 dernières minutes d’incubation avec LysoTracker, ajoutez Hoechst 33342 directement dans les puits à la concentration de travail recommandée par le fabricant et mélangez en balançant doucement la plaque. Retirez le milieu colorant à la fin de l’incubation et rincez les cellules une fois avec du PBS pré-chauffé pour réduire la fluorescence de fond. Immédiatement après le rinçage, ajoutez un médium de culture rouge sans phénol pré-chauffé.

Procéder directement à l’imagerie cellulaire vivante, en gardant le temps entre l’échange de tampon et l’acquisition des données cohérent sur tous les puits. Étiquetez les puits parallèles dans la plaque de culture pour la coloration de bêta-galactosidase afin de comparer les cellules très sénescentes avec les témoins pré-sénescents. Imagerie complète des cellules vivantes pour les puits de validation avant fixation.

Enregistrez les coordonnées de l’étape lors de l’imagerie en direct pour déplacer les mêmes champs après fixation. Ajoutez la solution de fixation du kit de coloration bêta-galactosidase de sénescence contenant 2 % de formaldéhyde et 0,2 % de glutaraldéhyde aux cellules. Couvrez l’assiette avec le couvercle et faites couver pendant 10 à 15 minutes à température ambiante.

Retirez le fixateur et rincez les puits deux fois avec du PBS. Ensuite, ajoutez la solution colorante bêta-galactosidase contenant le substrat X-gal à pH 6 dans chaque puits. Scellez la plaque avec un parafilm pour limiter l’évaporation pendant l’incubation, et placez la plaque dans une incubatrice sèche à 37 degrés Celsius sans dioxyde de carbone pendant 12 à 16 heures.

Après fixation et coloration, placez la plaque sur l’étage du microscope et déplacez les mêmes champs d’imagerie en utilisant les coordonnées de l’étape enregistrées. Inspectez les puits au microscope en champ clair et documentez le motif de coloration. Acquérir des images représentatives pour chaque affection et déterminer la fraction de cellules positives à la bêta-galactosidase associées à la sénescence par puits.

Les cellules sénécentes montraient des régions brillantes, spatialement étendues et enrichies par lysosomes, tandis que les témoins pré-sénéscents montraient un signal global plus faible avec des structures ponctuées discrètes. Les conditions sénescentes ont montré une proportion plus élevée de cellules positives au bêta-gal que les témoins pré-séniescents. Une forte corrélation a été observée entre l’intensité de LysoTracker et la zone bêta-gal positive associée à la sénescence à travers les puits de réplication.

L’intensité moyenne de LysoTracker dans le masque positif était plus élevée dans les cultures sénescentes que dans les cultures pré-sénescentes, ce qui en fait le discriminateur de champ le plus robuste entre les deux conditions. L’intensité intégrée de LysoTracker par noyau était également plus élevée dans les cultures sénécentes du champ représentatif présenté. Ce protocole permet aux chercheurs de mesurer le remodelage lysosomal dans les cellules vivantes, fournissant une lecture quantifiable par une seule cellule de la charge et de la progression de la sénescence.

Il est important de maintenir les réglages de coloration et d’imagerie identiques sur tous les puits, car les comparaisons d’intensité ne sont valables que lors d’une seule séance. Des études futures pourront étendre cette procédure aux modèles tridimensionnels, à d’autres types cellulaires et à la validation à travers différents systèmes et flux de travail de microscope.