Identification des candidats potentiels contre la tuberculose : guide étape par étape pour la synthèse, la détermination de la CMI et l’évaluation de la cytotoxicité chez les cellules de mammifères

L’objectif de nos recherches est le développement et la validation de nouveaux candidats médicaments antituberculeux visant à faire progresser les stratégies thérapeutiques. Le pipeline de dépistage phénotypique préventif peut être utilisé dans la recherche de nouveaux médicaments contre les souches de mycobactérie tuberculose. Pour commencer, rassemblez les réactifs nécessaires et préparez le mélange réactionnel en utilisant les proportions présentées.

Remuez le mélange de réaction à 85 degrés Celsius pendant 16 heures. Utilisez un évaporateur rotatif pour retirer le solvant. Ajoutez environ 20 millilitres de solution saturée de bicarbonate de sodium au résidu.

Filtrez cette suspension à l’aide d’un papier filtre cellulose qualitatif de 11 micromètres pour collecter les solides résiduels. Dissoudre les solides résiduels dans 50 millilitres de chloroforme. Utilisez un entonnoir séparateur pour rincer la solution de chloroforme avec 15 millilitres d’eau trois fois.

Enlever la couche d’eau à chaque fois. Ajoutez du sulfate de sodium anhydre à la phase organique pour éliminer l’eau résiduelle et séchez-la. Après évaporation du solvant, lavez le solide vert obtenu quatre fois avec 10 millilitres d’hexane chaud à environ 50 degrés Celsius.

À un milligramme de Composé 6, ajoutez un millilitre d’un mélange un à un d’acétonitrule et de méthanol pour préparer une solution de fond. Diluez la solution d’origine à 0,5 milligramme par millilitre et filtrez-la avant l’analyse. Chargez l’échantillon dans le système HPLC.

Utilisez un logiciel d’acquisition de données chromatographie pour acquérir et traiter les données. Réglez la méthode chromatographique pour utiliser une colonne C18 de phase inversée de 250 par 4,6 millimètres de taille de particules de cinq micromètres. Réglez le débit à 1,5 millilitre par minute, et réglez la détection UV à 254 nanomètres.

Configurez un gradient tel que présenté avec les changements de composition de phase programmés sur mobile. Transférez environ 15 à 20 milligrammes de Composé 6 dans un tube à résonance magnétique nucléaire ou RMN. Dissouds-le dans un volume approprié de DMSOD6.

Une fois les paramètres d’acquisition définis tels que présentés, acquérir le spectre RMN des protons à l’aide d’une séquence d’impulsions standard. Ajustez les paramètres d’acquisition. Activez le spectre RMN des protons et du carbone 13 et rapportez les variations chimiques en parties par million.

Visualisez et traitez les données RMN avec le fichier libre de désintégration par induction obtenu lors de l’expérience. Pour la purification par chromatographie du Composé 6, on remplit une colonne de gel de silice. Chargez le Compound 6 brut sur la colonne.

Éluez le composé et collectez les fractions. Surveillez les fractions à l’aide de chromatographie en couches fines et combinez les fractions contenant le produit pur. Ajoutez 100 microlitres de bouillon 7H9 complétés par une catalase ou ADC à 10 % d’albumine dextrose ou ADC à la colonne 12 de la plaque à 96 puits.

Ensuite, transférez 100 microlitres de bouillon 7H9 contenant 10 % d’ADC et 5 % de DMSO vers la colonne 11. Puis séquentiellement de la colonne neuf à la colonne un. Ajoutez 200 microlitres de la solution composée à la colonne 10, en attribuant une ligne par composé.

Pipeter 100 microlitres de la solution composée à deux fois la concentration d’essai la plus élevée jusqu’à la colonne 12 de la plaque à 96 puits. Transférez 100 microlitres de la colonne 10 à la colonne neuf et mélangez bien en pipettant pour commencer une dilution céréale en double. Poursuivre la dilution sériale séquentiellement jusqu’à la colonne un.

Ajoutez 100 microlitres de suspension bactérienne de Mycobacterium tuberculosis séquentiellement de la colonne 11 à la colonne un et couvrez la plaque. Scellez la plaque avec du parafilm et étouffez à 37 degrés Celsius pendant sept jours. Ensuite, ajoutez 60 microlitres de solution de resazurine à 0,01 % dans chaque puits de la plaque et couvrez-la.

Scellez la plaque avec du parafilm et faites-la couver à 37 degrés Celsius pendant 48 heures. Ensuite, vérifie le changement de couleur du bleu au rose. Préparez une solution de travail de 0,5 milligramme par millilitre MTT dans un DMEM sans sérum.

Obtenez des cellules Vero et HEPG2 traitées avec le composé 6 pendant 48 heures et inspectez-les pour évaluer les effets du traitement. Aspirez le milieu des plaques et ajoutez 50 microlitres de la solution de travail MTT à chaque puits dans des conditions de faible luminosité. Après une incubation de trois heures, ajoutez 100 microlitres de DMSO à chaque puits pour dissoudre les cristaux de formazan dans des conditions de faible luminosité.

Placez la plaque sur un vibrateur orbital à 100 tr/min pendant 15 minutes tout en la protégeant de la lumière. Inspectez les puits de contrôle pour confirmer la dissolution complète des cristaux. Mettez la plaque dans un lecteur de microplaques.

Réglez la longueur d’onde de référence de 630 à 690 nanomètres et vérifiez l’absorbance à 570 nanomètres. Préparez une solution de travail rouge neutre de 40 microgrammes par millilitre dans du DMEM sans sérum. Ensuite, préparez la solution de désorption rouge neutre contenant 1 % d’acide acétique glaciaire, 49 % d’éthanol et 50 % d’eau ultrapure en volume.

Une fois l’effet du composé 6 évalué sur les cellules Vero et HEPG2, retirez le milieu et ajoutez 100 microlitres de la solution neutre de travail filtrée à chaque puits. Incubez la plaque pendant deux heures à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone. Après avoir retiré la solution neutre rouge active, rincez chaque puits une fois avec 150 microlitres de PBS stérile.

Ajoutez 150 microlitres de la solution de désorption rouge neutre dans chaque puits. Placez la plaque sur un vibrateur orbital à 150 tr/min pendant 15 minutes pour extraire le colorant. Vérifiez les puits de contrôle pour confirmer l’extraction complète de la teinture.

Lire l’absorbance à 540 nanomètres avec un lecteur de microplaques. Le chromatogramme HPLC a montré que le composé 6 avait un temps de rétention de 14,11 minutes et une pureté de 99 %. Le spectre RMN des protons a montré des signaux caractéristiques pour la moitié pipéridine entre 1,50 et 3,13 parties par million. Un débardeur de méthyle à 2,38 parties par million.

Et des signaux aromatiques incluant des doublets à 6,97 et 7,17 parties par million et un multiplet à 7,63 à 7,75 parties par million. Le spectre RMN du carbone 13 montrait un signal de méthyle carbone à 23,81 parties par million, et des signaux liés à la pipéridine entre 24,85 et 49,70 parties par million. La plaque MTT montrait un gradient de couleur clair à travers les concentrations de composés, indiquant que la cytotoxicité était la plus élevée à de fortes concentrations de composés dans les puits translucides et la plus faible à de faibles concentrations de composés dans les puits violets profonds.

La plaque d’absorption rouge neutre montrait un gradient de couleur clair à travers les concentrations de composés, indiquant que la cytotoxicité était la plus élevée à de fortes concentrations de composés dans les puits translucides et la plus faible à de faibles concentrations de composé dans les puits rose profond. Ce protocole constitue un canon pour le développement de candidats médicaments contre la tuberculose basés sur le dépistage phénotypique. Il est important de prendre en compte et d’évaluer la faible solubilité des composés synthétisés lors de l’application du protocole.

Ces recherches peuvent servir de base à de futures études de biodisponibilité, d’infection par macrophages et in vivo.