Une méthode pour adapter Euglena gracilis à des substrats à base de manioc pour la culture hétérotrophe

Nos recherches portent sur l’adaptation des nouvelles feuilles d’Euglena gracilis aux déchets de manioc et sur l’étude de la croissance, de la réduction du cyanure et de la production de biomasse riche en protéines. Ce protocole peut être appliqué dans la transformation durable du manioc, la valorisation des déchets agricoles, la production d’aliments pour animaux et les systèmes biotechnologiques à faible coût. Pour commencer, étiquetez les fioles à bouchons stériles de 500 millilitres avec le type de substrat comme garri.

Marque la concentration cible appropriée sur la fiole. Étiquetez la fiole avec l’identification répliquée et la condition de stérilisation prévue comme autoclavée ou non autoclave. Placez un peseur sur la balance analytique.

Après avoir appuyé sur tare, pèse le garri pour qu’il corresponde au volume de travail final. Ajoutez aseptiquement le garri pesé dans une fiole stérile de 500 millilitres contenant 300 millilitres d’eau déionisée ou distillée. Remettez le bouchon ventilé sur chaque flasque.

Mélangez chaque suspension pendant trois minutes jusqu’à ce que le mélange soit homogénéisé. Si un brassage magnétique est utilisé, placez la fiole sur une plaque de brassage et réglez la vitesse à 200G pour former un vortex peu profond sans éclaboussures. Laissez la suspension s’hydrater sans être dérangée pendant 10 minutes à 25 degrés Celsius.

Serrez le bouchon d’évent juste avant la fermentation et faites tourner la fiole à la main cinq fois pour homogénéiser doucement le mélange et resuspendre le matériau déposé. Pour préparer des milieux à base de manioc supplémentaires, identifiez les fioles et pesez le substrat comme démontré précédemment pour atteindre 30 grammes par litre en fonction du volume de travail. Ajoutez aseptiquement le substrat pesé dans une fiole stérile contenant 300 millilitres d’eau déionisée ou distillée.

Remettez le bouchon ventilé sur chaque flasque. Hydratez et mélangez la suspension comme démontré précédemment. Vérifiez que les flasques sont équipées d’un bouchon ventilé stérile perméable au gaz pour permettre l’échange gazeux tout en minimisant la contamination environnementale.

Placez les flasques à la verticale à 25 degrés Celsius dans une zone désignée, à l’écart du soleil direct et du flux d’air à fort trafic, et faites couver les flasques sans agitation pendant au moins 72 heures. Notez la date et l’heure de début de la fermentation pour chaque flasque et chaque condition. Vérifiez que chaque fiole de 500 millilitres ne contient pas plus de 300 millilitres de liquide après la fermentation afin d’éviter l’ébullition lors de la stérilisation.

Une fois le bouchon ventilé desserré à une position serrée du doigt, appliquez du ruban indicateur autoclave sur la fiole. Après avoir chargé les flasques dans un plateau sécurisé pour l’autoclave, placez le plateau dans l’autoclave et sélectionnez le cycle liquide P13. Réglez les paramètres de stérilisation à 121 degrés Celsius pendant 30 minutes pour la stérilisation liquide.

Lance le cycle de l’autoclave. Après la fin du cycle, laissez la pression de la chambre d’autoclave revenir à la pression atmosphérique et ouvrez lentement la porte de l’autoclave. À l’aide de gants résistants à la chaleur, retirez les flasques et laissez-les refroidir à température ambiante.

Conservez les fioles refroidies toute la nuit à température ambiante avant l’inoculation. Utilisez directement le milieu de manioc fermenté sans autoclaver pour préserver les communautés microbiennes indigènes. Inoculez le milieu non autoclavé immédiatement après la période de fermentation de 72 heures afin de minimiser la contamination environnementale involontaire.

Maintenez une manipulation constante entre les répliques en utilisant les mêmes types de fioles à bouchon ventilé de 500 millilitres, le même volume de travail et la même durée de fermentation pour toutes les conditions du substrat. Inoculez Euglena gracilis dans un nouveau milieu nutritif hétérotrophe. Incuber les cultures dans l’obscurité totale à 28 degrés Celsius avec des vibrations orbitales continues à 120G jusqu’à ce que les cultures atteignent une croissance logarithmique moyenne.

À l’aide d’un microscope optique composé en mode champ clair, examinez les cultures à un grossissement total de 100x à 400x et confirmez la motilité active, la morphologie cellulaire allongée et de faibles niveaux d’insistance. Excluez les cultures présentant des débris cellulaires excessifs, une morphologie anormale ou une insistance élevée avant les expériences d’adaptation. Après avoir délicatement homogénéisé les cultures de démarrage en serrant le bouchon d’évent, faites tourner les flasques à la main pendant 15 secondes pour assurer une répartition uniforme des cellules sans provoquer de contraintes de cisaillement.

À l’aide d’un hémocytomètre de Neubauer, déterminez la densité cellulaire. Une fois la culture mélangée en faisant tourner la fiole pendant 15 secondes, pipettez un millilitre de culture dans un tube stérile de microcentrifuge de 1,5 millilitre. Nettoyez l’hémocytomètre et la gaine de couverture avec 70 % d’éthanol et laissez sécher à l’air libre l’hémocytomètre et la toile de protection.

Pipettez 10 microlitres de culture sur les deux grilles de l’hémocytomètre et placez la couvre sur l’échantillon humide. En utilisant la microscopie en champ clair avec un objectif de 10x, concentrez-vous sur la grille et comptez les cellules à l’intérieur d’un ensemble défini de carrés sur la grande grille en appliquant les règles standard de frontière. Répétez les décomptes de cellules dans la seconde chambre et calculez la moyenne des cellules par millilitre et la densité cellulaire.

Ajustez les volumes d’inoculation pour obtenir un inoculum final de 5 % volume par volume sur tous les milieux expérimentaux. Préparez des inocules séparés pour chaque condition de traitement afin de maintenir des densités cellulaires initiales constantes entre les groupes expérimentaux. Ajoutez l’inoculum préparé d’E. gracilis à des milieux de manioc autoclavés et non autoclavés préparés à des concentrations finales de garri de 10, 20 et 30 grammes par litre.

Utiliser des volumes d’inoculation égaux dans toutes les conditions de traitement pour standardiser la densité cellulaire initiale. Après avoir serré le bouchon ventilé, faites doucement tourner la flasque en cercle pendant 15 secondes pour répartir les cellules. Incubez les cultures dans l’obscurité totale à 25 degrés Celsius pour initier la croissance hétérotrophe.

Minimiser l’agitation des milieux non autoclavés afin de préserver la structure de la communauté microbienne native et la stratification du substrat. Mélangez toutes les cultures une fois par jour en faisant un léger tourbillon manuel pendant 15 secondes pour maintenir le contact entre les cellules d’E. gracilis et le manioc en suspension. À l’aide d’une pointe de pipette stérile, toutes les 48 heures, prélevez aseptiquement un millilitre d’échantillons de chaque culture.

Serrez le bouchon ventilé et faites doucement tourner la fiole de culture pendant 15 secondes avant l’échantillonnage pour assurer une répartition uniforme des cellules et des matériaux en suspension. Après avoir transféré une aliquote de culture dans un tube stérile de microcentrifuge de 1,5 millilitre, diluez l’échantillon avec de l’eau déionisée selon les besoins pour améliorer la visualisation des cellules individuelles. Préparez une lame de microscopie à montage humide en pipettant 10 microlitres de l’échantillon dilué sur une lame de microscope propre et en recouvrant l’échantillon d’une barbe de couverture.

À l’aide d’un microscope optique composé en mode champ clair, examinez les échantillons à un grossissement total de 100x à 400x et évaluez la motilité cellulaire, la morphologie et la fréquence d’insistance comme indicateurs de l’état d’adaptation. Tous les sept jours, transférez aseptiquement 20 % de volume par volume de chaque culture dans un milieu de manioc fraîchement préparé avec la même concentration de garri et les mêmes conditions de stérilisation. Maintenir des volumes de transfert constants entre les passages et répéter le passage en série jusqu’à ce que les cultures présentent une croissance constante, une motilité soutenue et une faible fréquence d’insistance dans un milieu manioc de 30 grammes par litre.

Après une adaptation à haute concentration au manioc et une analyse comparative de croissance, utilisez des bandes colorimétriques pour évaluer les niveaux de cyanure et observer la couleur développée. Après centrifugation, récoltez la biomasse pour une analyse en aval. Dans des conditions de culture entièrement sombres, les cultures cultivées à 30 grammes par litre de garri ont montré une croissance intégrée plus élevée que les concentrations plus faibles.

Des concentrations plus faibles de garri, de 10 à 20 grammes par litre, ont montré une croissance détectable mais réduite et plus variable. Des concentrations plus élevées de 40 à 50 grammes par litre atteignaient des densités cellulaires maximales élevées mais montraient une stabilisation retardée et une plus grande variabilité. Les tests d’exclusion du bleu de trypan ont indiqué que les cultures maintenues à 30 grammes par litre de garri conservaient une forte viabilité à travers les périodes échantillonnées.

Des concentrations plus élevées de garri ont montré des réductions transitoires de viabilité, suivies d’une récupération partielle avec une variabilité accrue dans le temps. Les résultats positifs comprenaient des cellules arrondies ou semi-insistantes avec une motilité réduite qui sont restées intactes à travers des sous-cultures répétées. Les cultures adaptées d’E. gracilis ont montré une croissance reproductible sur plusieurs types de substrats et une stabilisation plus précoce avec une diminution du déclin tardif par rapport aux cultures sauvages.

La mise en œuvre réussie du protocole a permis d’obtenir une biomasse d’E. gracilis avec une teneur mesurable en protéines brutes, quantifiée par analyse externe en laboratoire utilisant la méthode de Dumas à combustion. Les pourcentages de protéines observés dans les cultures adaptées étaient comparables à ceux mesurés dans les cultures de type sauvage avec une production totale de protéines plus élevée, correspondant à une accumulation accrue de biomasse. Ce protocole permet aux chercheurs d’étudier la croissance d’Euglena, la réduction du cyanure, la production de biomasse et le potentiel nutritionnel dans différents environnements à base de manioc.

Le défi crucial de ce protocole est de maintenir une température stable, des conditions de culture constantes et une communauté microbienne équilibrée pour la croissance d’Euglena. Des études futures pourront optimiser et étendre ce protocole, améliorer le rendement en protéines et tester différentes applications industrielles utilisant divers flux de déchets de manioc à grande échelle.