Name: Une méthode pour adapter Euglena gracilis à des substrats à base de manioc pour la culture hétérotrophe (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-06-12T14:40:00.000+00:00
Duration: 12 min 37 s
Description: Découvrez une méthode d'adaptation d'Euglena gracilis à des substrats de manioc pour la culture hétérotrophe. Ce protocole permet la valorisation des déchets agricoles et la production de biomasse protéique.

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<table><tbody><tr><td>Autoclave - 533LS Steam Stérilisateur</td><td>Getinge</td><td>533LS</td><td>Stérilisation à la vapeur des milieux de culture de manioc. Stériliser les milieux en utilisant un cycle liquide.</td></tr><tr><td>Bright-Line&trade; Hématimètre lame de remplacement</td><td>Millipore Sigma</td><td>BR723015- 100EA</td><td>Lames de recouvrement spéciales épaisses conçues pour l'utilisation avec l'hématimètre.</td></tr><tr><td>Pulpe séchée de manioc</td><td>Psaltry International</td><td>N/A</td><td>Substrat de manioc fourni</td></tr><tr><td>Pellets de manioc</td><td>Psaltry International</td><td>N/A</td><td>Substrat de manioc fourni</td></tr><tr><td>Peaux de manioc</td><td>Psaltry International</td><td>N/A</td><td>Substrat de manioc fourni</td></tr><tr><td>Substrat de manioc (garri)</td><td>Fournisseur local</td><td>N/A</td><td>Garri dérivé du manioc utilisé comme source de carbone; préparé avec de l'eau déionisée.</td></tr><tr><td>Centrifugeuse Thermo Scientific Sorvall ST16 Centrifugeuse</td><td>Thermo Scientific Sorvall ST16 Centrifugeuse</td><td>75004241</td><td>Capable de &ge;3 500 &times; g, utilisée pour la récolte de la biomasse.</td></tr><tr><td>Tubes de centrifugation Par exemple Axygen (A Marque Corning)</td><td>Corning</td><td>MCT-150-C-S</td><td>Stériles, volume minimum de 1,5 mL</td></tr><tr><td>Eau propre Par exemple UltraPure&trade; DNase/RNase- Eau distillée exempte</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10977035</td><td>Déionisée ou distillée. Utilisée pour la préparation des milieux</td></tr><tr><td>Microscope optique composé</td><td>Olympus</td><td>N/A</td><td>Microscope composé standard adapté à l'observation et au dénombrement des cellules de routine.</td></tr><tr><td>Test du cyanure Bandelettes, colorimétrique. CN- 10-30 mg/L</td><td>MQuant</td><td>110044</td><td>Détection semi-quantitative du cyanure. Eliminer comme déchet dangereux</td></tr><tr><td>Barquette de pesage stérile standard</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-549-750</td><td>Utilisée pour le pesage des substrats de manioc et de la biomasse sèche.</td></tr><tr><td>Euglena gracilis (lignée adaptée au manioc)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Souche adaptée au manioc générée dans cette étude</td></tr><tr><td>Euglena gracilis (Type sauvage)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Souche de référence non adaptée. Maintenir les mêmes conditions standard.</td></tr><tr><td>Composants du milieu de croissance d'Euglena</td><td>Diverses</td><td>N/A</td><td>Milieu d'Euglena de base préparé selon les formulations standard du laboratoire.</td></tr><tr><td>Lyophiliseur à console FreeZone de 6 litres</td><td>Labconco</td><td>70061xxxx</td><td>Utilisé pour la déshydratation de la biomasse</td></tr><tr><td>Hématimètre avec lignes standard</td><td>Weber Scientific</td><td>NC1587539</td><td>Utilisé pour le dénombrement manuel des cellules.</td></tr><tr><td>Agitateur magnétique avec plaque chauffante</td><td>IKA</td><td>N/A</td><td>Facultatif; améliore la cohérence lors de la préparation des milieux et de la suspension des substrats.</td></tr><tr><td>Micropipettes (P20, P200, P1000)</td><td>Eppendorf</td><td>N/A</td><td>Pipettes à volume réglable utilisées pour les transferts liquides aseptiques.</td></tr><tr><td>Mini-centrifugeuse</td><td>Eppendorf</td><td>N/A</td><td>Facultatif; facilite la granulométrie rapide lors de la récolte de la biomasse.</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM996</td><td>Utilisé pour le scellement temporaire des flacons ou des plaques lorsque les bouchons aérés ne sont pas disponibles.</td></tr><tr><td>Bandelettes indicatrices de pH</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-640-520</td><td>Alternative au pHmètre pour une évaluation qualitative rapide des milieux de culture.</td></tr><tr><td>pHmètre avec sonde Thermo Scientific Orion Star A211 pHmètre de banc Thermo Scientific Orion</td><td>Thermo Scientific Orion Star A211 pHmètre de banc Thermo Scientific Orion</td><td>13-645-519</td><td>Calibré avant utilisation. Pour mesurer le pH du surnageant de culture</td></tr><tr><td>Stockage réfrigéré (4&deg;C)</td><td>Frigidaire</td><td>FRT18S6JW7</td><td>Stockage à court terme des milieux</td></tr><tr><td>Incubateur à agitateurs (sombre)</td><td>Thermolyne</td><td>M49235</td><td>Incubateur à agitateurs orbital capable de 100&ndash;150 RPM, plage de température 24&ndash;28 &deg;C; utilisé dans l'obscurité pour favoriser la croissance hétérotrophe d'Euglena.</td></tr><tr><td>Flacon de pulvérisation (32oz)</td><td>Boardwalk</td><td>BWK03010</td><td>Utilisé pour la stérilisation sur le plan de travail et la manipulation aseptique de routine (solution d'éthanol à 70%)</td></tr><tr><td>Logiciel de tableur</td><td>Microsoft Excel</td><td>N/A</td><td>Collecte, organisation et analyse des données</td></tr><tr><td>Embouts de pipettes stériles</td><td>Eppendorf</td><td>N/A</td><td>Embouts stériles jetables compatibles avec les pipettes P20, P200 et P1000.</td></tr><tr><td>Pipettes sérologiques stériles (5, 10, 25 mL)</td><td>Corning</td><td>N/A</td><td>Pipettes stériles individuellement emballées utilisées pour les transferts de culture et l'échantillonnage.</td></tr><tr><td>Solution de bleu de trypan 0,4%, liquide, filtrée stérile, adaptée à la culture cellulaire</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td>Colorant vital utilisé pour l'évaluation de la viabilité cellulaire par le test d'exclusion du bleu de trypan.</td></tr><tr><td>Tubes pour le prélèvement d'échantillons (50 mL)</td><td>Falcon</td><td>14-432-22</td><td>Pour le prélèvement d'échantillons de pH et de cyanure</td></tr><tr><td>Flacons Erlenmeyer avec bouchon aéré (250

une méthode pour adapter euglena gracilis à des substrats à base de manioc pour la culture hétérotrophe

A Method for Adapting Euglena gracilis to Cassava-Based Substrates for Heterotrophic Cultivation

Les résultats représentatifs suivants illustrent les résultats attendus lorsque le protocole décrit est appliqué avec succès, ainsi que la gamme des résultats observés dans des conditions sous-optimales. Les données représentatives correspondant à ces résultats sont présentées dans la Figure 1, Figure 2, Figure 3, Figure 4, Figure 5, Figure 6, Figure 7. Ensemble, ces résultats fournissent des conseils pratiques pour interpréter la dynamique de croissance, la viabilité, la morphologie et les résultats protéiques lors de l’adaptation d’E. gracilis à des substrats à base de manioc dans des conditions de culture hétérotrophes et entièrement sombres. De plus, ces résultats valident les principaux résultats biologiques du protocole, notamment une adaptation réussie, une croissance soutenue, une grande viabilité, une morphologie stable, une performance constante à travers les substrats et une production de protéines mesurable.
Tout au long des expériences, trois réplications par traitement (tous types de milieux de manioc) ont été utilisées. Nous reconnaissons que le nombre de réplications dépend de la discrétion et des limites logistiques de tout groupe suivant les protocoles ci-dessus. L’application réussie de ce protocole aboutit à une croissance hétérotrophe soutenue d’E. gracilis dans des milieux à base de garri dans des conditions entièrement sombres. Les résultats positifs se caractérisent par des trajectoires de croissance sigmoïdes et fluides, une divergence limitée entre les réplicés et des densités cellulaires stables en phase tardive. Les traits morphologiques qui ont signifié des résultats positifs et ont été observés de manière constante dans des populations adaptées comprenaient la rondeur cellulaire et l’épaisseur des membranes cellulaires. En revanche, les cellules effondrées malades apparaissent généralement irrégulières, fragmentées ou structurellement compromises et sont associées à une viabilité réduite, les distinguant des formes intactes, arrondies ou semi-encisées observées dans des cultures adaptées. À titre de référence, des images représentatives d’E. gracilis de type sauvage présentant une morphologie allongée caractéristique sont incluses (Figure 8) afin de distinguer la structure cellulaire de base des formes adaptées ou modifiées. Les cultures cultivées à 30 g de L-1 garri ont montré une croissance intégrée plus élevée, mesurée par la surface sous la courbe de croissance (AUC), comparée à des concentrations plus faibles, ce qui suggère une utilisation plus efficace du substrat de manioc et une adaptation physiologique réussie (Figure 1).
Les résultats sous-optimaux sont couramment observés à des concentrations de garri plus faibles (10–20 g L-1), où la croissance est détectable mais réduite en intensité et plus variable selon les réplications. À des concentrations plus élevées (40–50 g L-1), les cultures peuvent atteindre des densités cellulaires maximales élevées ; cependant, ces conditions présentent fréquemment une stabilisation retardée ou une variabilité temporelle accrue (Figure 2).
Dans les expériences réussies, la viabilité cellulaire reste élevée tout au long de la période de culture, avec seulement de légères fluctuations en milieu d’expérience. Les tests d’exclusion du bleu de trypan indiquent que les cultures maintenues à 30 g de L-1 garri conservent une forte proportion de cellules viables (non colorées) par rapport aux cellules non viables (colorées en bleu) à travers les périodes échantillonnées (Figure 3). Les écarts par rapport à ce schéma, notamment une proportion accrue de cellules colorées, une motilité réduite ou des déplacements vers des morphologies arrondies ou effondrées, peuvent indiquer des conditions sous-optimales et servir de déclencheurs précoces au dépannage. Les évaluations de viabilité et morphologique étaient basées sur des critères d’observation cohérents, incluant l’intégrité cellulaire, la motilité directionnelle et la prévalence relative des formes allongées versus arrondies ou effondrées.
Les résultats sous-optimaux se caractérisent par des réductions transitoires de viabilité, le plus souvent observées à des concentrations de garri plus élevées. Une récupération partielle peut être observée à des moments ultérieurs ; cependant, ces conditions présentent une variabilité accrue de la viabilité sur la période de culture (Figure 4). Ces schémas de croissance montrent que les concentrations intermédiaires de substrat (par exemple, 30 g L-1) assurent un équilibre entre la disponibilité des nutriments et le stress, ce qui entraîne une croissance plus stable. Ces tendances reflètent l’impact des conditions de prétraitement et de l’adaptation progressive sur la performance des cultures, car l’exposition progressive à une complexité croissante du substrat favorise une meilleure stabilité physiologique et un comportement de croissance reproductible. Des concentrations plus faibles limitent la production de biomasse, tandis que des concentrations plus élevées entraînent une plus grande variabilité et un retard de stabilisation.
L’évaluation morphologique fournit un indicateur qualitatif du statut d’adaptation. Les résultats positifs incluent l’émergence et la persistance de cellules arrondies ou semi-encisées avec une motilité réduite qui restent intactes à travers des sous-cultures répétées (Figure 5).
En revanche, les cultures sous-optimales, principalement associées à des souches sauvages ou à des adaptations précoces, présentent des transitions brusques de cellules allongées et mobiles à des morphologies irrégulières ou effondrées qui coïncident avec une stabilité de croissance réduite.
Lorsque le protocole est appliqué à d’autres substrats dérivés du manioc, y compris la pulpe, les granulés et les pelures, les cultures adaptées d’E. gracilis présentent une croissance reproductible sur plusieurs types de substrats. Les résultats positifs se caractérisent par une stabilisation plus précoce des courbes de croissance et une diminution du déclin en phase avancée par rapport aux cultures de type sauvage (Figure 6).
Les résultats sous-optimaux incluent un début de croissance retardé ou une variabilité accrue de la réplication, en particulier dans les substrats à plus grande hétérogénéité physique.
La mise en œuvre réussie du protocole donne une biomasse d’E. gracilis avec une teneur en protéines brutes mesurable, quantifiée par analyse en laboratoire externe utilisant la méthode de combustion (Dumas). Les pourcentages de protéines observés dans les cultures adaptées sont comparables à ceux mesurés dans les cultures de type sauvage, avec une production totale plus élevée correspondant à une accumulation accrue de biomasse (Figure 7).
La surveillance de la chimie des médias a soutenu les interactions culture-substrat lors de l’adaptation et a validé l’inclusion des mesures de pH et de cyanure dans le protocole. Les valeurs de pH ont montré des changements progressifs au fil du temps, indiquant une activité métabolique et une utilisation du substrat, avec des tendances plus stables dans les cultures adaptées. Les mesures au cyanure ont également confirmé cela, les cultures adaptées montrant des réductions des niveaux détectables, tandis que les cultures sauvages restaient plus variables. Ensemble, ces résultats démontrent que ces étapes de suivi capturent efficacement les changements dans la chimie des médias liés à l’adaptation et soutiennent l’interprétation de la performance culturelle. Bien que les mécanismes sous-jacents n’aient pas été étudiés, cela représente un domaine important pour de futures recherches, en particulier pour des applications à l’échelle industrielle.
Le flux de travail de maintenance et de consolidation à long terme a soutenu la viabilité continue de la lignée adaptée d’Euglena gracilis sur de longues périodes de culture. Les cultures maintenues par des passages répétés conservaient systématiquement la motilité, la morphologie caractéristique et un comportement de croissance stable sur les cycles de maintenance. Bien que la performance à long terme n’ait pas été évaluée quantitativement, ces observations fournissent des preuves représentatives que la lignée adaptée peut être maintenue de manière fiable dans les conditions spécifiées.
Ensemble, ces résultats confirment que le protocole d’adaptation soutient une croissance robuste, une viabilité et une production de biomasse d’E. gracilis sur des substrats à base de manioc, avec des performances constantes et des niveaux de cyanure réduits au fil du temps.
Toutes les figures et tableaux sont fournis comme des fichiers séparés et ne sont pas intégrés dans le document manuscrit. Les préférences de placement des figures et des tables sont indiquées dans le texte du manuscrit à l’aide de notes entre crochets (par exemple, (Figure 1)). Sauf indication contraire, tous les chiffres et tableaux doivent apparaître sous la section Résultats Représentatifs dans la publication finale.
Toutes les figurines sont soumises sous forme de fichiers individuels, avec des figurines multipanneaux fournies sous forme d’une seule image combinée. Les images de microscopie comportent des barres d’échelle dans chaque panneau. Les figures de données incluent des axes étiquetés avec des unités de mesure définies, et les barres d’erreur sont spécifiées dans les légendes correspondantes.
Tous les tableaux sont soumis sous forme de fichiers .xls ou .xlsx individuels et contiennent des données numériques brutes ou résumées sans mise en page décorative.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70741/70741fig1.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 1"> 
Figure 1 : Dynamique de croissance d’E. gracilis cultivée à 10, 20 et 30 gL-1 garri dans des conditions entièrement obscures. Les densités moyennes des cellules sont indiquées dans le temps pour chaque concentration de substrat. Les barres d’erreur représentent le SEM entre réplications biologiques. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70741/70741fig1large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70741/70741fig2.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 2"> 
Figure 2 : Performance de croissance d’E. gracilis à des concentrations élevées de garri (30–50 g L-1). Les trajectoires de densité cellulaire illustrent les différences de densité de pic, de temps de stabilisation et de variabilité à travers des concentrations de substrat plus élevées. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70741/70741fig2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70741/70741fig3.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 3"> 
Figure 3 : Tendances de viabilité cellulaire d’E. gracilis cultivées à 30 gL-1 garri mesurées par exclusion de Trypan Blue. La proportion de cellules viables est indiquée à travers les points temporels échantillonnés. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70741/70741fig3large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70741/70741fig4.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 4"> 
Figure 4 : Fluctuations de viabilité d’E. gracilis cultivées à des concentrations garri plus élevées. Les changements transitoires de viabilité cellulaire sont montrés tout au long de la période expérimentale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70741/70741fig4large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70741/70741fig5.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 5"> 
Figure 5 : Morphologie représentative des populations adaptées d’E. gracilis. Des images représentatives de microscopie optique inversée montrent des cellules arrondies et semi-enquistées observées après adaptation. Barre d’échelle = XX μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70741/70741fig5large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70741/70741fig6.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 6"> 
Figure 6 : Performance de croissance d’E. gracilis adapté et de type sauvage sur des substrats dérivés du manioc. Les trajectoires de croissance sont indiquées pour les cultures adaptées et sauvages cultivées sur plusieurs produits de manioc. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70741/70741fig6large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70741/70741fig7.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 7"> 
Figure 7 : Teneur en protéines brutes et production totale de protéines de la biomasse d’E. gracilis cultivée en manioc. La teneur en protéines a été quantifiée par analyse externe à l’aide de la méthode de combustion SGS (Dumas). La production totale de protéines est affichée parallèlement à l’accumulation de biomasse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70741/70741fig7large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70741/70741fig8.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 8"> 
Figure 8 : Morphologie représentative de l’E. gracilis sauvage dans des conditions standard (grossissement 40X). Image représentative d’Euglena gracilis saine et non adaptée montrant une morphologie allongée caractéristique sous microscopie optique. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70741/70741fig8large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.</a>

Une méthode pour adapter Euglena gracilis à des substrats à base de manioc pour la culture hétérotrophe

Cassava processing generates nutrient-rich by-products that remain underutilized due to variable composition, cyanogenic compounds, and active microbial ...

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