Expression ciblée de la GFP dans le follicule pileux ex vivo utilisant transduction virale
17 mars 2008
Le follicule pileux est un appendice très complexe de la peau contenant une multiplicité de types de cellules. Le follicule subit vélo constant à travers la vie de l'organisme, y compris la croissance et la résorption de la croissance dépend de cellules souches spécifiques. Le ciblage du follicule par les gènes et les cellules souches pour modifier ses propriétés, en particulier, la nature de la tige du cheveu est discuté. Systèmes de livraison du follicule pileux sont décrits, comme les liposomes et de vecteurs viraux pour la thérapie génique. La nature des cellules souches du follicule pileux est discuté, en particulier, sa pluripotence.
Le follicule pileux est une annexe cutanée complexe composée de six cylindres concentriques comportant plusieurs types cellulaires distincts qui produisent des protéines hautement spécialisées. Le cycle continu du follicule pileux à travers ses stades de croissance distincts rend cette annexe adaptée à une thérapie génique ciblée, qui pourrait potentiellement corriger la calvitie et la perte de pigmentation des cheveux. Dans cette vidéo, nous démontrons une méthode de culture histologique des cheveux, de peau en cours de croissance, et de transduction ex vivo des follicules pileux avec la protéine verte fluorescente.
Cette technique de transduction efficace est utile pour suivre l'activité du promoteur de divers gènes d'intérêt dans différentes régions du follicule tout au long de son cycle de croissance. Je m'appelle Robert Hoffman. Je suis président d'Anti-Cancer Inc.
Aujourd'hui, nous allons vous montrer des procédures très puissantes de thérapie génique du follicule pileux. Ce protocole commence par l'histiculture de la peau, suivie d'un traitement à la collagénase. Tout d'abord, sacrifiez les souris six jours après l'épuisement, puis prélève la peau du dos au niveau du tissu sous-cutané.
Après avoir retiré l'épiderme, le tissu sous-cutané est éliminé. La peau est ensuite rincée dans du PBS sans calcium ni magnésium. À ce stade, la peau disséquée est transférée dans un milieu après le rinçage au PBS.
Les échantillons de peau sont découpés en petits morceaux d'environ un millimètre cube. Une fraction des échantillons est mise de côté et cultivée dans du RPMI 1640 contenant 10 % de sérum fœtal de veau comme témoins non traités. Le reste des échantillons est incubé dans deux mg par ml.
Solution de collagénase. Dans du milieu RPMI pendant 45 minutes à 3,75 heures à 37 degrés, les échantillons digérés sont ensuite lavés dans du PBS sans calcium ni magnésium. Les cultures histologiques peuvent être infectées par un virus pour la transduction de GFP. Maintenant que la collagénase a rendu les follicules pileux plus accessibles au virus afin d'induire les follicules pileux.
Pour exprimer la GFP, ils sont d'abord infectés par un adénovirus. Un plasmide portant la GFP est ensuite ajouté à la peau traitée à la collagénase. Les histocultures à 2,4 millions à 5 milliards d'unités formant des colonies par millilitre.
Après l'ajout du virus, les échantillons sont placés dans l'incubateur pendant une à six heures après la transduction virale de GFP dans des cultures histologiques de peau. Environ 24 heures après la récolte, les spécimens peuvent être greffés sur des souris nues ou C57BL/6. L'expression de GFP peut ensuite être évaluée par microscopie à fluorescence, réalisée soit sur les cultures histologiques, soit visualisée in vivo sur la peau greffée. Afin de déterminer l'efficacité de la transduction de GFP, le nombre total de follicules pileux et le nombre de follicules pileux positifs pour GFP sont déterminés en microscopie à champ clair et en microscopie à fluorescence.
Cinq champs aléatoires au microscope, couvrant une surface de 0,581 millimètre carré, sont analysés. Pour l'expression de la GFP, au moins 500 poils par échantillon sont comptés afin de déterminer le pourcentage de follicules pileux positifs pour la GFP. Les follicules pileux dans lesquels la GFP est visualisée dans n'importe quelle partie du bulbe ou de la tige pileuse sont considérés comme positifs pour la GFP.
Nous venons de vous présenter une méthode très efficace pour la transduction de GFP et des follicules pileux, qui s'avérera extrêmement utile pour la thérapie génique. Ces connaissances revêtent une importance clinique, car elles ont des implications pour le traitement de l'alopécie ou de la calvitie, la prévention de l'alopécie induite par la chimiothérapie, et la modification permanente de la couleur des cheveux. Merci d'avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.
Aperçu
Le follicule pileux est une annexe cutanée complexe qui subit un cycle continu, ce qui en fait une cible pour la thérapie génique. Cet article traite des méthodes de culture histologique et de transduction génique dans les follicules pileux, qui pourraient avoir des implications dans le traitement de la perte de cheveux.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Thérapie génique
- Dermatologie
Contexte
- Les follicules pileux sont composés de plusieurs types cellulaires et structures.
- Ils passent par des stades de croissance influencés par les cellules souches.
- La thérapie génique pourrait potentiellement traiter des affections telles que l’alopécie.
- La compréhension de la biologie du follicule pileux est essentielle pour des traitements efficaces.
Objectif de l'étude
- Démontrer une méthode de culture histologique des follicules pileux.
- Explorer des techniques de transduction génique pour les follicules pileux.
- Évaluer l'efficacité de l'expression de la GFP dans les follicules pileux.
Méthodes utilisées
- Culture histologique d'échantillons de peau suivi d'un traitement à la collagénase.
- Infection des follicules pileux par un adénovirus porteur d'un plasmide GFP.
- Évaluation de l'expression de la GFP par microscopie de fluorescence.
- Analyse de l'efficacité de la transduction par comptage des follicules pileux positifs pour la GFP.
Résultats principaux
- Une transduction efficace des follicules pileux avec la GFP a été obtenue.
- L'expression de la GFP peut être visualisée in vivo et en cultures histologiques.
- La méthode présente un potentiel pour des applications en thérapie génique.
- Les implications pour le traitement de l'alopecie et la modification de la couleur des cheveux ont été discutées.
Conclusions
- Le présent étude décrit une méthode puissante de thérapie génique pour les follicules pileux.
- La compréhension de la transduction génique peut conduire à des progrès dans le traitement de la perte de cheveux.
- Les recherches futures pourraient se concentrer sur les applications cliniques de ces techniques.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
La transduction virale ex vivo ciblée des follicules pileux permet une livraison génique précise à des populations cellulaires folliculaires distinctes, soutenant l'analyse fonctionnelle de l'expression des gènes dans un tissu complexe et régénératif. Cette approche renforce la confiance prédictive dans les stratégies de thérapie génique pour les voies de médecine dermatologique et régénérative, notamment lorsque la spécificité cellulaire et l'efficacité quantitative de la transduction sont critiques. Les résultats quantitatifs et la reproductibilité de cette méthode en font un outil précieux pour la validation précoce des cibles et la recherche translationnelle dans le développement biopharmaceutique.
Applications stratégiques en recherche et développement biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Permet la validation fonctionnelle de gènes cibles dans des populations cellulaires définies du follicule pileux.
- Permet une détection mécanistique des risques en autorisant le suivi spatial et temporel de l'expression génique par GFP.
- Facilite l'évaluation quantitative de l'activité promoteur et de l'efficacité de la livraison génique.
Développement de criblages et de tests
- Offre un système reproductible ex vivo pour évaluer les vecteurs et constructions de transfert génique.
- Génère des lectures standardisées et quantifiables de l'efficacité de transduction à l'aide de la microscopie à fluorescence.
- Permet le développement de tests pour le criblage de candidats à la thérapie génique ciblant la biologie de la peau et des follicules pileux.
Recherche translationnelle et préclinique
- S'aligne sur des systèmes pertinents pour la maladie afin de modéliser des troubles du follicule pileux et des thérapies régénératives.
- Permet une continuité allant de la découverte à la validation préclinique en autorisant la greffe in vivo et le suivi longitudinal de l'expression génique.
- Facilite les décisions d'avancement ajustées au risque pour les programmes de thérapie génique ciblant les annexes cutanées.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Cette méthode de transduction virale ex vivo s'intègre dans la continuité découverte-préclinique, assurant un lien entre la validation in vitro et l'évaluation fonctionnelle in vivo des candidats thérapeutiques ciblant la biologie du follicule pileux.
- Biologie de la découverte : Soutient la vérification d'hypothèses et la clarification des voies biologiques en permettant une analyse ciblée de l'expression génique dans les sous-populations de follicules pileux.
- Écrans : Fournit des données quantitatives et reproductibles sur l'efficacité de transduction afin d'orienter le choix des vecteurs et des constructions.
- Analytique : Offre des mesures robustes basées sur la fluorescence pour comparer les conditions et les résultats de transfert génique.
- Recherche translationnelle : Facilite la continuité préclinique par la greffe et le suivi in vivo de follicules génétiquement modifiés.
- Réutilisation en milieu professionnel : Propose une plateforme évolutive et adaptable pour évaluer diverses modalités de thérapie génique dans des modèles de peau et de follicules pileux.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans la validation des cibles de thérapie génique et réduit l'ambiguïté mécanistique dans les tissus complexes.
- Valeur opérationnelle : Standardise les protocoles de délivrance et de quantification génique afin d'assurer la reproductibilité et la possibilité de passage à l'échelle.
- Valeur stratégique : Éclaire les décisions d'aller/arrêt et le tri du portefeuille en fournissant des données quantitatives de transduction spécifiques aux types cellulaires.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des actifs de thérapie génique ciblant des indications dermatologiques et régénératives.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Requiert une expertise en culture tissulaire ex vivo, en manipulation de vecteurs viraux et en microscopie de fluorescence.
- Nécessite un accès à une infrastructure analytique pour l'imagerie quantitative et l'analyse de données.
- Implique une standardisation inter-équipes des protocoles de traitement des tissus et des critères d'évaluation afin d'assurer la reproductibilité.
- Une adaptation peut être nécessaire selon les espèces, les types de follicules pileux ou les vecteurs de transfert génique.
- L'efficacité et la spécificité peuvent varier selon le type de vecteur, le choix du promoteur et l'état du tissu.
