Name: Traduction d’ARNm in vitro sans cellules chez les lysats de Drosophila (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-06-12T15:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Apprenez la traduction d'ARNm in vitro sans cellules chez les lysats de Drosophila pour étudier la synthèse protéique et le contrôle translationnel. Ce protocole permet des recherches robustes en biologie moléculaire.

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<table><tbody><tr><td>Aluminum foil sheet</td><td>Reynolds</td><td>N/A</td><td>Standard household aluminum foil; any equivalent commercial brand acceptable.</td></tr><tr><td>Amino acids mixture</td><td>Promega</td><td>L4461</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Apple cider vinegar</td><td>Heinz</td><td>N/A</td><td>Commercial apple cider vinegar (5% acidity); any equivalent brand acceptable.</td></tr><tr><td>Apple or grape fruit juice</td><td>Jumex</td><td>N/A</td><td>Commercial grape juice; or any equivalent commercial brand.</td></tr><tr><td>Bacteriological agar&nbsp;</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>9002-18-0</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Boric acid (H3BO3)</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>B6768</td><td>BioReagent, Molecular Biology grade, &ge;99.5%, powder; used for preparation of TBE buffer.</td></tr><tr><td>Cap: Anti reverse cap (ARCA): 3&acute;-O-Me-m7G(5&acute;)ppp(5&acute;)G RNA cap structure</td><td>BioLabs</td><td>S1411S</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Cap: m7G(5')ppp(5')G RNA cap structure analog</td><td>New England Biolabs</td><td>S1404S</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Cap: Non-functional cap analogue G(5&acute;)ppp(5&acute;)A</td><td>New England Biolabs</td><td>S1406</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Centrifuge Tube (15 mL)</td><td>Corning&nbsp;</td><td>430053</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Complete, EDTA-free protease inhibitor cocktail</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Creatine phosphokinase from rabbit muscle</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>C-3755</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Creatine phosphoric acid, disodium salt</td><td>Merck</td><td>1120A47950</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Dehydrated baker&acute;s yeast</td><td>Fleischmann's</td><td>N/A</td><td>Commercial active dry yeast; any equivalent brand acceptable.</td></tr><tr><td>Diethyl pyrocarbonate&nbsp;</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>D5758</td><td>97%(NNR)</td></tr><tr><td>DNA Clean &amp; Concentrator-5</td><td>Zymo Research</td><td>D4004</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Drosophila melanogaster wild-type strain Oregon-R</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center, Indiana, USA</td><td></td><td>https://bdsc.indiana.edu/index.html ; mutant strains of Drosophila melanogaster, as well as wild-type reference strains of other Drosophila species, such as virilis, pseudoscura, grinshawi, hydei, etc. are also provided by this Stock Center.</td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td>ACS reagent, 99.4-100.6%, powder; used for preparation of TBE buffer.</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>SLBH4583V</td><td>99.5%(titration)</td></tr><tr><td>Hydrogen peroxide (H2O2)</td><td>Equate</td><td>N/A</td><td>Commercial (~2.5-3.5% hydrogen peroxide solution; any equivalent brand acceptable.</td></tr><tr><td>In vitro transcription mMessage mMachine T7, T3, or SP6 Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM1344 and AM1348</td><td>N/A</td></tr><tr><td>KOAc, also termed KCH3COO</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>Several</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Lb broth (lennox)</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>L3022</td><td>1kg&nbsp;</td></tr><tr><td>Luciferase assay system</td><td>Promega&nbsp;</td><td>E1501</td><td>N/A</td></tr><tr><td>MAXIscript T7, T3, or SP6 in vitro transcription Kit</td><td>Invitrogen</td><td>AM1316 and AM1312</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Mg(OAc)2, also termed Mg(CH3COO)2</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>Several</td><td>N/A</td></tr><tr><td>NaCl (sodium chloride)</td><td>J.T Baker&nbsp;</td><td>B17W53</td><td>ACS Reagent</td></tr><tr><td>Oligonucleotides</td><td>Any company</td><td>N/A</td><td>Sequence-specific.</td></tr><tr><td>Pasive lysis 5X buffer</td><td>Promega</td><td>E1941</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Pipet Tips</td><td>Axygen</td><td>T-200-Y</td><td>200 microliters yellow tips.</td></tr><tr><td>Pipet Tips</td><td>Axygen</td><td>T-1000-B</td><td>1ml blue tips.</td></tr><tr><td>Pipet Tips&nbsp;</td><td>Axygen</td><td>T-300</td><td>0.5-10 microliters clear tips.</td></tr><tr><td>Propionic Acid</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>79-09-04</td><td>ACS reagent grade, &ge;99.5%, liquid.</td></tr><tr><td>PYREX&reg; 5 mL Glass Pestle Tissue Grinder</td><td>&nbsp; PYREX&reg;&nbsp;&nbsp;</td><td>7724-5</td><td>N/A</td></tr><tr><td>QIAprep spin plasmid miniprep kit</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>N/A</td></tr><tr><td>QIAquick gel extraction kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Rabbit reticulocyte lysate (RRL)</td><td>Promega&nbsp;</td><td>L4960</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Renilla luciferase (RLuc) assay system</td><td>Promega&nbsp;</td><td>E2820</td><td>N/A</td></tr><tr><td>RNasin ribonuclease inhibitor</td><td>Promega</td><td>N2111A</td><td>N/A</td></tr><tr><td>RNeasy minielute RNA clean up kit</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes</td><td>Thermo Scientific</td><td>87735 (However, it depends on the molecular size cutoff).</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Sodium hypochlorite (bleach)</td><td>Clorox</td><td>N/A</td><td>Commercial bleach (~5-6% NaOCl); any equivalent commercial brand with similar concentration acceptable.</td></tr><tr><td>Spermidine</td><td>Merck</td><td>85558</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Stainless steel sieve</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Any commercial supplier.</td></tr><tr><td>Taq plus precision DNA polymerase</td><td>Stratagene</td><td>600211-51</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Transfer ribonucleic acid (tRNA) from bovine liver type XI</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>9014-25-9 or R4752</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Tris (Tris base)</td><td>IBI Scientific</td><td>IB70145</td><td>Molecular biology grade powder; used for preparation of TBE buffer.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>SLBX9437</td><td>Laboratory Grade</td></tr><tr><td>UltraPure Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16500500</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Unflavored gelatin powder</td><td>Knox</td><td>N/A</td><td>Commercial unflavored gelatin powder; any equivalent brand acceptable.</td></tr><tr><td>Unrefined cane sugar (piloncillo)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Commercial Mexican unrefined whole cane sugar; any equivalent brand acceptable.</td></tr><tr><td>Vector: pBluescript SK or KS (+/-)</td><td>Stratagene</td><td>200301</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Vector: pGEM-T or pGEM-T Easy.&nbsp;</td><td>Promega</td><td>

traduction d’arnm in vitro sans cellules chez les lysats de drosophila

Cell-Free In Vitro mRNA Translation In Drosophila Lysates

Traduction d’ARNm in vitro sans cellules chez les lysats de Drosophila

Cell-free mRNA in vitro translation has played a crucial role in the understanding of the protein synthesis process during gene expression across ...

Notre recherche utilise un système de traduction cellulaire sans cellules de drosophile pour étudier la synthèse des protéines et la révélation traductionnelle à différents stades du développement des insectes. Ce protocole reproduit fidèlement les événements de traduction in vivo spécifiques au développement des insectes, contrairement aux lysats provenant de métazoaires éloignés. Pour commencer, ouvrez le logiciel de clonage Benchling.Sélectionnez un plasmide approprié pour insérer le construit contenant une région non traduite en 5', un cistron rapporteur de luciférase de luciole, ou Fluc, une région non traduite en 3' et une queue de polyadénylate ou poly(A) en aval d'un promoteur T7. Utilisez le site de restriction unique KPN1 situé immédiatement en aval de la queue poly(A) pour linéariser chaque construit plasmidique avant la transcription. Vérifiez la présence de pics nets et bien résolus des construits obtenus par séquençage avant de les utiliser comme modèles pour la transcription in vitro.Séparer l'ADN linéarisé par électrophorèse sur gel d'agarose à 1 % à 100 volts pendant une heure. Extraire l'ADN linéarisé du gel. Placer celui-ci dans un microtube et ajouter le tampon

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Nous décrivons ici un ensemble de montage...

Toute Mont ARN fluorescent<em&gt; In situ</emHybridation&gt; d&#39;<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryons

Nous décrivons ici les modalités de l'extraction et de purification de l'ARNm et de métabolites...

Purification des relevés de notes et de métabolites<em&gt; Drosophila</em&gt; Têtes

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Amélioration de la détection du Nord Blot des petits ARN espèces en Drosophila melanogaster

Le contrôle de la synthèse des protéines se produit principalement à l’étape d’initiation de la traduction, dont les déficiences sont liées à divers troubles. Pour mieux comprendre leur étiologie, nous avons décrit ici un protocole utilisant des ovocytes de Xenopus laevis évaluant la traduction du transcrit mos en présence d’un mutant du facteur d’initiation de traduction eIF4G1.

Xenopus laevis comme un modèle pour identifier traduction Dépréciation

La purification par affinité des ribosomes (TRAP) est capable de capturer la traduction spécifique du type cellulaire de l’ARNm. Nous rapportons ici le premier protocole TRAP dédié à l’isolement de l’ARNm dans des populations cellulaires rares d’embryons de drosophile.

TRAP-rc, Translating ribosome Purification par affinité à partir de populations de cellules rares de<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryons

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Préparation à moyen terme de<em&gt; Drosophila</em&gt; Extraits d&#39;embryons pour les expériences protéomiques

Un tandem RNA isolation (TRIP) pour la récupération des complexes protéine-ARNm endogène formé décrit. Plus précisément, complexes ARN-protéine sont réticulés en vivo, polyadénylé RNAs sont isolés des extraits avec oligo (décollement) perles et ARNm particulier est capturés avec des oligonucléotides antisens RNA mis à jour le. Protéines liés à l’ARNm sont détectés par l’analyse par immunotransfert.

Une procédure d’Isolation RNA axée sur les oligonucléotides Tandem pour récupérer des Complexes protéine-ARNm eucaryotes

Ici, nous présentons un protocole pour la visualisation, la détection, l'analyse et le suivi du trafic endogène d'ARNm dans la chambre d'oeufs de Melasophila melanogaster vivante utilisant des balises moléculaires, la microscopie confocale de disque spinning, et l'analyse open-source logiciel.

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Microinjection embryonnaire pour la transgenèse chez la drosophile

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