Évaluation de l’effet des filtres et préfiltres recouverts sur l’infectiosité et la concentration du virus Phi6 en aérosol

Nous étudions l’effet des préfiltres et des revêtements antiviraux dans la réduction de l’infectiosité et des concentrations de virus aéroportés en intérieur. Les approches actuelles passent à côté de dynamiques réalistes du flux d’air. Notre protocole recrée les conditions d’aérosol et mesure à la fois les virus infectieux et la charge virale totale.

Pour commencer, diluez la suspension purifiée du bactériophage phi6 dans un tampon de phosphate de potassium de 20 millimolaires contenant un chlorure de magnésium millimolaire ajusté au pH 7,2. Assemblez tous les matériaux de filtre, de pré-filtre et de revêtement antiviral dans l’armoire de biosécurité pour effectuer les tests de surface. Évaluer l’activité antivirale de tous les matériaux de revêtement à base de cuivre, ou de composants actifs en cuivre et argent intégrés dans des matrices propriétaires, à savoir A6, B4, VS et VS B, sur des pièces d’essai plates.

Ensuite, pipettez 20 microlitres de solution ph diluée sur des pièces d’essai revêtues pour effectuer l’essai de viabilité en surface. Étalez l’échantillon uniformément sur une surface de deux par deux centimètres à l’aide d’un triangle de verre stérile. Incubez les échantillons à 22 degrés Celsius jusqu’à quatre points temporels, y compris une minute, cinq minutes, une heure ou trois heures.

Ajoutez 180 microlitres de bouillon LB frais à la surface pour récupérer les virus après chaque période. Lavez la surface en pipettant de 10 à 20 fois pour collecter l’échantillon. Utilisez une boîte de Petri en plastique comme surface de contrôle.

Quantifier l’efficacité antivirale des revêtements de surface à l’aide d’un test de plaque pour mesurer le nombre de particules virales infectieuses et de la réaction en chaîne de la transcriptase inverse par polymérase, ou qRT-PCR, pour déterminer le nombre de copies du génome viral. Diluez la suspension purifiée et concentrée de bactériophages phi6 comme démontré précédemment pour obtenir une concentration virale allant de 2,5 fois 10 à la puissance de 10, puis 4,08 fois 10 à la puissance de 11 unités formant des plaques par millilitre. Ensuite, assemblez la chambre d’aérosol expérimentale à l’aide d’un corps cylindrique en verre avec un couvercle assorti.

Insérez l’échafaudage métallique interne dans la chambre et fixez des joints isolants pour assurer un joint hermétique. Utilisez un nébuliseur combiné à une pompe à air pour générer un apport stable et reproductible d’aérosols viraux. Titrez la solution virale utilisée dans le nébuliseur avant et après chaque expérience pour surveiller la stabilité.

Réglez le débit d’aérosol à huit litres par minute dans la chambre. Pour réduire l’humidité lors de mesures prolongées, dirigez environ les trois quarts du flux d’aérosol vers les gaz d’échappement via un filtre à particules à haute efficacité, ou filtre HEPA. Laissez entrer le quart restant du débit correspondant à deux litres par minute dans la chambre.

Utilisez un entonnoir pour diriger le flux d’aérosol vers le filtre ou la surface du pré-filtre à l’intérieur de la chambre. Déshumidifier le flux d’air sortant à l’aide d’un dessicateur pour protéger le filtre HEPA et le débitmètre contre l’humidité excessive. En utilisant la pompe externe, créez une pression négative à l’intérieur du système et soutenez davantage le flux d’air pour garantir un échappement efficace par la sortie.

Évaluer les propriétés antivirales des préfiltres en polyester et bulpren non recouverts ou recouverts de VS B, ainsi que des matériaux en fibre de verre double couche dans la chambre aérosol. Pour évaluer l’effet antiviral par échantillonnage par impaction, placez une boîte de Petri contenant 20 millimolaires tampon HEPES à pH 7,2 directement sous le préfiltre de test afin de maximiser le dépôt de particules. Sinon, pour tester l’effet antiviral des filtres GF2, installez un impinger tourbillonnant tout en verre à triple buse, connecté à une pompe externe pour la collecte des aérosols.

Maintenez un débit d’air à travers le préfiltre ou filtre de test à deux litres par minute. Augmentez l’apport total d’air à 10 litres par minute en utilisant une vanne supplémentaire après la sortie de la chambre. Capturez les aérosols dans cinq millilitres de tampon HEPES de 20 millimolaires.

Et reconstituez le tampon évaporé toutes les 30 minutes. Pour un échantillonnage triple, effectuez des contrôles sans préfiltres ni filtres pendant 15 minutes avant et après chaque expérience. Après la course de contrôle pré-expérimentation, insérez le filtre ou le pré-filtre dans la chambre et faites fonctionner le système pendant trois heures.

Collectez des aérosols viraux en récupérant un millilitre de suspension dans des boîtes de Petri contenant 20 millilitres de tampon toutes les 30 minutes. Retirez le filtre et effectuez une prise de contrôle post-expérience. Prélever des échantillons toutes les 30 minutes pendant l’expérience pour obtenir huit échantillons qRT-PCR et titration chacun par expérience.

Dans les expériences d’impinger, il faut prélever des échantillons de titration une seule fois à la fin de la série de trois heures. Utilisez 800 microlitres de l’échantillon collecté pour l’analyse qRT-PCR et les 200 microlitres restants pour la titrage virale. Congelez instantanément des échantillons qRT-PCR dans de l’azote liquide et conservez-les à 80 degrés Celsius.

Traiter immédiatement les échantillons de titration du virus à l’aide d’un test de plaque. Les tests de viabilité de surface ont démontré que tous les revêtements testés ont réussi à inactiver le virus, avec des réductions significatives observées dans les cinq premières minutes. Le revêtement de surface à base de cuivre, B4, a obtenu la réduction la plus rapide, diminuant les taux d’infection de trois ordres de grandeur en cinq minutes, et atteignant une inactivation complète avec une limite de détection inférieure à 100 unités de formation de plaques par millilitre en 15 minutes.

Le revêtement A6 a permis l’inactivation totale du virus en 25 minutes, et le VS B en 60 minutes. Le revêtement VS a présenté le taux d’inactivation le plus lent parmi les matériaux testés. Les pré-filtres étudiés BP6, S11 et FMR5 ont été tout aussi efficaces pour réduire le nombre de virus infectieux, les traversant de 1,5 à 2 ordres de grandeur par rapport au contrôle sans filtre.

Les filtres GF2 ont démontré des performances supérieures, réduisant la charge virale d’au moins six ordres de grandeur, et aucune plaque infectieuse du virus phi6 n’a été détectée dans la limite de détection. Le revêtement VS B n’a pas significativement affecté l’efficacité de la filtration du virus infectieux comparée aux préfiltres non revêtus. Les résultats de la qRT-PCR ont montré que les préfiltres réduisaient le nombre de copies du génome viral jusqu’à deux ordres de grandeur.

Le filtre GF2 a montré une diminution allant jusqu’à quatre ordres de grandeur par rapport au contrôle sans filtre. Bien que les différences entre les préfiltres et le contrôle soient restées insignifiantes pendant les 30 premières minutes, l’efficacité du filtrage mécanique augmentait à partir du délai de 60 minutes. De plus, l’application du revêtement VS B n’a eu aucun effet mesurable sur le nombre de génomes viraux passant par le milieu filtrant.

Ce protocole permet aux chercheurs de quantifier l’inactivation virale, l’efficacité de filtration et les différences entre les particules infectieuses et la charge virale totale. Un défi majeur est le temps de contact très court en surface du virus lors du flux d’air, ce qui limite l’efficacité des revêtements antiviraux. De futures études pourront explorer la combinaison de revêtements avec des UV ou tester les performances dans des systèmes de ventilation réels et avec divers virus.