Marquage endogène fluorescent médié par CRISPR/Cas9 des gènes spécifiques à la lignée germinale chez Caenorhabditis elegans

Nous utilisons le marquage endogène basé sur CRISPR pour étudier la localisation et la dynamique des protéines germinales chez C. elegans. Les transgènes conventionnels peuvent affecter l’expression de la lignée germinale, mais ce protocole marque les protéines au locus endogène sous contrôle natif. Pour commencer, identifiez les gènes candidats ayant une expression prédominante dans les cellules gonades ou germinales à l’aide de bases de données publiques et de la littérature publiée.

Après avoir ouvert l’entrée UniProt pour la protéine cible, cliquez sur Structure pour évaluer les caractéristiques structurales et les domaines protéiques et identifier un site de marquage fluorescent approprié. Faites défiler vers le bas et ouvrez l’entrée de la base de données AlphaFold pour vérifier les valeurs de confiance du modèle. Cliquez sur Domaines pour des classifications structurelles spécifiques.

Ensuite, ouvrez la page du gène cible dans WormBase. Faites défiler vers le bas et cliquez sur le widget Séquences, ainsi que sur le lien principal de la transcription pour ouvrir la page de la transcription. Faites défiler jusqu’à la section Séquences et cliquez sur l’option spécifique pour révéler la séquence recoupée de la transcription sélectionnée.

Sur la page web de l’outil de conception ARN Guide IDT CRISPA-Cas9, copiez-collez la première séquence d’exons du gène cible depuis la page WormBase, puis sélectionnez C, elegans dans le menu déroulant Espèces pour la conception d’ARN ou de gRNA guide. Cliquez sur le bouton DESIGN pour obtenir et examiner la séquence gRNA recommandée en tête et sa séquence PAM correspondante. Sur SnapGene, sélectionnez Séquence pour identifier le point de clonage entre le promoteur CeU6 et les régions de l’échafaudage gRNA.

Copiez la séquence d’ARNG depuis la page de l’outil IDT, collez-la dans la boîte de dialogue d’insertion, puis cliquez sur Insérer pour intégrer l’espaceur dans le plasmide d’expression CRISPR. Pour confirmer la précision de l’insertion de gRNA, sélectionnez la séquence et cliquez sur Afficher les alignements pour comparer le résultat du séquençage de Sanger base par base avec la séquence attendue. Pour construire le plasmide donneur, copiez les séquences génomiques du groupe d’homologie à partir de WormBase.

Dans SnapGene, collez la séquence et cliquez sur Insérer. Ensuite, faites un clic droit sur le site d’insertion pour ouvrir la fenêtre Set DNA Color et changez-la en orange pour marquer la jonction. Copiez la séquence d’insertion de la protéine fluorescente verte ou GFP et collez-la directement à la position indiquée.

Puis cliquez sur Ajouter une fonctionnalité. Nommez la fonctionnalité GFP. Changez la couleur de son affichage en vert et cliquez sur OK pour compléter l’assemblage plasmide in silico du donneur.

Pour introduire une substitution silencieuse dans le gabarit plasmidique du donneur afin d’empêcher la recoupe de Cas9 après intégration, copiez l’espaceur de gRNA à 19 nucléotides du vecteur d’expression. Dans l’onglet plasmide du donneur, collez la séquence dans la barre de recherche Trouver la séquence d’ADN pour localiser le site cible et sélectionnez la position spécifique du nucléotide à muter. Dans Remplacer la base, saisissez un nouveau nucléotide et cliquez sur Insérer.

Faites un clic droit sur la base modifiée et utilisez Set DNA Color pour changer sa couleur en rouge. Aligner les résultats du séquençage Sanger du plasmide donneur avec la séquence attendue pour confirmer l’intégrité. Préparez le mélange d’injection en combinant le plasmide d’expression CRISPR, le plasmide donneur et les marqueurs de co-injection dans de l’eau stérile double distillée pour obtenir un volume final de 10 microlitres à la concentration indiquée.

Ensuite, centrifugez le mélange à 10 000 g pendant 10 à 20 minutes pour éliminer les particules et éviter l’obstruction du capillaire de microinjection. Utilisez un extracteur d’aiguille pour créer des aiguilles de microinjection à partir de capillaires en verre avec un long conic et une pointe tranchante, adaptées à l’injection gonadique, tout en optimisant empiriquement les réglages polaires. Chauffez une pipette microcapillaire et cassez-la en deux parties pour créer un outil de chargement.

Fixez une ampoule aspiratrice en caoutchouc à l’extrémité large de la pipette microcapillaire raccourcie. Aspirez environ un microlitre de mélange d’injection dans le chargeur. Insérez le chargeur à l’arrière de l’aiguille d’injection et distribuez doucement le mélange d’injection.

Placez l’aiguille chargée à l’horizontale pendant 10 minutes pour former une colonne continue et laisser la solution se déposer vers la pointe. Montez l’aiguille sur le microscope d’injection et mettez la pointe au point à l’aide d’optiques à champ clair. Ouvrez la pointe de l’aiguille par un contact délicat avec le bord d’une gaine de couverture dans de l’huile d’halocarbure et vérifiez le débit.

Pour cultiver les vers en vue de l’injection, maintenir les vers sauvages N2 sur des plaques de milieux générés par des bactéries OP50. Sélectionnez les hermaphrodites au stade L4 sur une plaque saine et incubez à 20 degrés Celsius pendant 10 heures afin d’obtenir de jeunes adultes avec des lignées germinales bien développées. Transférez les vers dans une assiette non semée pour réduire la transmission bactérienne.

Préparez un tampon sec à 2 % d’agarose sur une lame en verre. Et appliquez une goutte d’huile d’halocarbone. Utilisez un cueillette pour transférer un ver sur le coussinet d’agarose et l’immobiliser.

Utilisez un objectif à faible grossissement pour orienter la gonade en vue de l’injection. Utilisez des commandes micro-manipulatrices pour positionner l’aiguille à un angle de 20 à 40 degrés par rapport au ver. Utilisez un grossissement élevé pour focaliser la lignée germinale distale.

Avancez le ver vers l’aiguille et placez la pointe dans le syncytium gonadical. Injectez la solution jusqu’à ce que la gonade gonfle. Retirez l’aiguille et repositionnez-la pour les injections suivantes.

Ajoutez un tampon M9 pour ramollir et décomposer partiellement le coussinet d’agarose pour libérer les vers. Transférez chaque ver sur une plaque de récupération individuelle. Ensuite, répétez les injections pour 20 à 25 vers.

Criblez la progéniture F1 pour détecter des marqueurs de co-injection et sélectionnez des animaux positifs au marqueur. Transférez chaque ver F1 sur une plaque individuelle et laissez pondre un à deux jours pour la ponte. Lysez chaque ver F1 dans un tampon de protéinase K pour préparer des modèles PCR.

Effectuez la PCR par jonction en utilisant une amorce génomique en dehors du bras d’homologie et une amorce interne de la marque. Et conserver les plaques correspondantes des animaux F1 positifs à la PCR. Isoler la progéniture F2 des lignées F1 PCR positives sur des plaques individuelles pour produire une descendance.

Lyse adultes pour le génotypage. Effectuer la PCR à l’aide d’amorces flanquant les bras d’homologie pour distinguer les allèles de type sauvage et les allèles knock-in par la taille du produit. Utilisez l’outil SnapGene pour vérifier et valider une intégration correcte aux jonctions d’insertion gauche et droite en alignant les résultats du séquençage Sanger avec la séquence génomique éditée attendue.

Utilisez la microscopie à fluorescence pour vérifier l’expression et la localisation de la lignée germinale. Élargissez les lignées homozygotes confirmées. Maintenir des stocks et des lignes validées en cryoconservation pour un stockage à long terme.

Le dépistage par PCR de la progéniture F1 a révélé des knock-ins réussis identifiés par un amplicon PCR de jonction de 1 550 paires de bases utilisant une base génomique flanquante et une base interne GFP. L’absence de la bande de 1 550 paires de bases chez la plupart des animaux F1 indiquait une absence d’intégration détectable de la cible, ce qui correspond à une transmission non intégrative de l’ADN plutôt qu’à une réparation dirigée par l’homologie. La détermination de la zygosité chez la descendance F2 dérivée des lignées PCR positives à jonction distingue les allèles par la taille de la bande à 1 345 paires de bases comme allèle de type sauvage, et 2 344 paires de bases comme allèle knock-in.

Les hétérozygotes montrent les deux groupes. Les échantillons homozygotes knock-in n’ont pas la bande de taille wild-type, et ceux avec intégration ratée ne montrent que le produit de taille wild-type. Une validation supplémentaire de la lignée homozygote de la GFP a été réalisée par imagerie microscopique confocale, où la fluorescence de la GFP dans les cellules germinales avec un signal enrichi dans la région spermatogène a été observée.

Ce protocole permet une analyse in vivo de la localisation et de la dynamique des protéines dans la lignée germinale de C. elegans. Une conception soigneuse des balises et une validation approfondie sont essentielles pour préserver la fonction des protéines et minimiser les faux positifs. De futures études pourront utiliser ce flux de travail pour suivre la localisation des protéines et explorer les interactions potentielles lors du développement de la lignée germinale.