Name: Marquage endogène fluorescent médié par CRISPR/Cas9 des gènes spécifiques à la lignée germinale chez Caenorhabditis elegans (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-05-29T13:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 37 s
Description: Apprenez le marquage endogène fluorescent par CRISPR/Cas9 des protéines germinales chez Caenorhabditis elegans. Ce protocole permet d'obtenir des lignées stables avec expression native pour l'analyse de localisation in vivo.

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	<li>Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transparent+window+into+biology:+a+primer+on+Caenorhabditis+elegans.">A transparent window into biology: a primer on Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).</li><li>Pazdernik, N., Schedl, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+germ+cell+development+in+Caenorhabditis+elegans.">Introduction to germ cell development in Caenorhabditis elegans.</a> Adv Exp Med Biol. 757, 1-16 (2013).</li><li>Ebbing, A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+transcriptomics+of+C.+elegans+males+and+hermaphrodites+identifies+sex-specific+differences+in+gene+expression+patterns.">Spatial transcriptomics of C. elegans males and hermaphrodites identifies sex-specific differences in gene expression patterns.</a> Dev Cell. 47 (6), 801-813.e6 (2018).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+single-cell+architecture+of+gene+expression+in+Caenorhabditis+elegans+germ+cells.">Spatiotemporal single-cell architecture of gene expression in Caenorhabditis elegans germ cells.</a> Cell Discov. 11 (1), 26 (2025).</li><li>Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+in+C.+elegans:+extrachromosomal+maintenance+and+integration+of+transforming+sequences.">Efficient gene transfer in C. elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences.</a> EMBO J. 10 (12), 3959-3970 (1991).</li><li>Kelly, W. G., Fire, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+silencing+and+the+maintenance+of+a+functional+germline+in+Caenorhabditis+elegans.">Chromatin silencing and the maintenance of a functional germline in Caenorhabditis elegans.</a> Development. 125 (13), 2451-2456 (1998).</li><li>Robert, V. J., Sijen, T., van Wolfswinkel, J., Plasterk, R. H. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+and+RNAi+factors+protect+the+C.+elegans+germline+against+repetitive+sequences.">Chromatin and RNAi factors protect the C. elegans germline against repetitive sequences.</a> Genes Dev. 19 (7), 782-787 (2005).</li><li>Merritt, C., Seydoux, G. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+solutions+for+the+germline.">Transgenic solutions for the germline.</a> WormBook. , 1-21 (2010).</li><li>Fr&#x00F8;kj&#x00E6;r-Jensen, C., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-copy+insertion+of+transgenes+in+Caenorhabditis+elegans.">Single-copy insertion of transgenes in Caenorhabditis elegans.</a> Nat Genet. 40 (11), 1375-1383 (2008).</li><li>Vallin, E., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+collection+of+Mos1+transposon+insertion+mutants+for+the+C.+elegans+research+community.">A genome-wide collection of Mos1 transposon insertion mutants for the C. elegans research community.</a> PLoS One. 7 (2), e30482 (2012).</li><li>Dickinson, D. J., Ward, J. D., Reiner, D. J., Goldstein, B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+the+Caenorhabditis+elegans+genome+using+Cas9-triggered+homologous+recombination.">Engineering the Caenorhabditis elegans genome using Cas9-triggered homologous recombination.</a> Nat Methods. 10 (10), 1028-1034 (2013).</li><li>Friedland, A. E., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heritable+genome+editing+in+C.+elegans+via+a+CRISPR-Cas9+system.">Heritable genome editing in C. elegans via a CRISPR-Cas9 system.</a> Nat Methods. 10 (8), 741-743 (2013).</li><li>Nance, J., Fr&#x00F8;kj&#x00E6;r-Jensen, C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caenorhabditis+elegans+transgenic+toolbox.">The Caenorhabditis elegans transgenic toolbox.</a> Genetics. 212 (4), 959-990 (2019).</li><li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+CRISPR-Cas9-mediated+genome+editing+to+study+spermatogenesis+in+Caenorhabditis+elegans.">Protocol for CRISPR-Cas9-mediated genome editing to study spermatogenesis in Caenorhabditis elegans.</a> STAR Protoc. 4 (4), 102720 (2023).</li><li>Khan, A. A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+efficient+ligation-independent+cloning+system+for+CRISPR/Cas9-based+genome+editing+in+plants.">A highly efficient ligation-independent cloning system for CRISPR/Cas9-based genome editing in plants.</a> Plant Methods. 13, 86 (2017).</li><li>Ghanta, K. S., Ishidate, T., Mello, C. C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+for+precision+genome+editing+in+Caenorhabditis+elegans.">Microinjection for precision genome editing in Caenorhabditis elegans.</a> STAR Protoc. 2 (3), 100748 (2021).</li><li>Rieckher, M., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+microinjection.">Caenorhabditis elegans microinjection.</a> Bio Protoc. 7 (19), e2584 (2017).</li><li>Medley, J. C., Hebbar, S., Sydzyik, J. T., Zinovyeva, A. Y. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+nucleotide+substitutions+effectively+block+Cas9+and+allow+for+scarless+genome+editing+in+Caenorhabditis+elegans.">Single nucleotide substitutions effectively block Cas9 and allow for scarless genome editing in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 220 (1), iyab199 (2022).</li><li>Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+stable+transgenic+C.+elegans+using+microinjection.">Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection.</a> J Vis Exp. (18), e833 (2008).</li><li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bright+monomeric+green+fluorescent+protein+derived+from+Branchiostoma+lanceolatum.">A bright monomeric green fluorescent protein derived from Branchiostoma lanceolatum.</a> Nat Methods. 10 (5), 407-409 (2013).</li><li>Bajar, B. T., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+brightness+and+photostability+of+green+and+red+fluorescent+proteins+for+live+cell+imaging+and+FRET+reporting.">Improving brightness and photostability of green and red fluorescent proteins for live cell imaging and FRET reporting.</a> Sci Rep. 6, 20889 (2016).</li><li>Bindels, D. S., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mScarlet:+a+bright+monomeric+red+fluorescent+protein+for+cellular+imaging.">mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging.</a> Nat Methods. 14 (1), 53-56 (2017).</li><li>He, S., Cuentas-Condori, A., Miller, D. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NATF+(native+and+tissue-specific+fluorescence):+a+strategy+for+bright,+tissue-specific+GFP+labeling+of+native+proteins+in+Caenorhabditis+elegans.">NATF (native and tissue-specific fluorescence): a strategy for bright, tissue-specific GFP labeling of native proteins in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 212 (2), 387-395 (2019).</li><li>Paix, A., Folkmann, A., Seydoux, G. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+genome+editing+using+CRISPR-Cas9+and+linear+repair+templates+in+C.+elegans.">Precision genome editing using CRISPR-Cas9 and linear repair templates in C. elegans.</a> Methods. 121-122, 86-93 (2017).</li></ol>

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Beijing Lablead Biotech Co., Ltd.</td><td>QZ02</td><td>Composant pour la préparation de plaques d'agar NGM</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>NOVON</td><td>ZZ14011</td><td>Préparation de tampons d'agarose à 2%</td></tr><tr><td>Souche Caenorhabditis elegans N2 </td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td></td><td>Souche de fond pour l'injection</td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>Eppendorf</td><td>5425</td><td>Clarifier le mélange d'injection</td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Beijing Chemical Reagents Company</td><td>57-88-5</td><td>Composant pour la préparation de plaques d'agar NGM</td></tr><tr><td>Plasmid de marqueur de co-injection rol-6 (su1006) (pRF4)</td><td>Guangshuo Ou Lab</td><td></td><td>Marqueur roller pour enrichir les candidats</td></tr><tr><td>Microscope confocal</td><td>ZEISS</td><td>LSM880 + Airyscan</td><td>Valider l'expression/localisation GFP</td></tr><tr><td>Di-Potassium hydrogen phosphate (K2HPO4)</td><td>Sinapharm</td><td>CAS: 7758-11-4</td><td>Composant pour la préparation de plaques d'agar NGM</td></tr><tr><td>Di-Sodium hydrogen phosphate (Na2HPO4)</td><td>Sinapharm</td><td>CAS: 7558-79-4</td><td>Composant pour la préparation du tampon M9</td></tr><tr><td>Ladder d'ADN</td><td>Mei5 Biotechnology, Co., Ltd.</td><td>MF288-01</td><td>Référence de taille pour les gels d'agarose</td></tr><tr><td>Armature de plasmide donneuse (pPD95.75)</td><td>Addgene</td><td>1494</td><td>Armature pour la construction du donneur HDR</td></tr><tr><td>Système d'électrophorèse</td><td>Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd.</td><td>112-0630</td><td>Séparation des amplicons PCR sur les gels d'agarose pour le criblage des jonctions et le génotypage de zygosité</td></tr><tr><td>Souche Escherichia coli OP50</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td></td><td>Source de nourriture pour les vers</td></tr><tr><td>Plasmid de marqueur de co-injection fluorescent (pPD122.11)</td><td>Fire Lab</td><td></td><td>Co-marqueur GFP pour enrichir les candidats</td></tr><tr><td>Stéréomicroscope fluorescent</td><td>SOPTOP</td><td>SZX12-HT</td><td>Détection des vers vivants pour les marqueurs de co-injection fluorescents</td></tr><tr><td>GelRed Nucleic Acid Gel Stain</td><td>Mei5 Biotechnology, Co., Ltd.</td><td>MF079-plus-01</td><td>Visualisation des bandes d'ADN</td></tr><tr><td>Capillaires en verre</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100F-4</td><td>Utilisés avec un tireur de pointe pour fabriquer des aiguilles d'injection</td></tr><tr><td>Huile halocarbone 700</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8898-50ML</td><td>Prévenir la dessiccation pendant l'injection</td></tr><tr><td>Incubateur</td><td>Wuhan Ruihua Instrument &amp; Equipment Co., Ltd.</td><td>HP400S</td><td>Maintenir les vers à une température standard</td></tr><tr><td>Sulfate de magnésium (MgSO4)</td><td>Sinapharm</td><td>CAS: 7487-88-9</td><td>Composant pour la préparation de plaques d'agar NGM et de tampon M9</td></tr><tr><td>Pipettes microcapillaires</td><td>KIMBLE</td><td>71900-50</td><td>Chauffées et cassées pour créer un outil de chargement</td></tr><tr><td>Unité de microinjecteur</td><td>Eppendorf</td><td>FemtoJet 4i</td><td>Délivrer des impulsions de pression contrôlées du mélange d'injection dans la gonade distale via une aiguille de microinjection (commandée par pédale)</td></tr><tr><td>Verres de couverture de microscope</td><td>Fisherbrand</td><td>12545A 22&times;30-1</td><td>Préparation de tampons d'agarose à 2% pour le montage et l'immobilisation des vers pendant la microinjection; Ouvrir les pointes des aiguilles d'injection contre le bord du porte-objet</td></tr><tr><td>Microscope pour microinjection</td><td>ZEISS</td><td>Axio Observer.A1</td><td>Microscope d'injection</td></tr><tr><td>Tireur de pointe</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>Modèle P97</td><td>Transformer les capillaires en verre en aiguilles d'injection</td></tr><tr><td>Thermocycleur PCR</td><td>Bio-Rad</td><td>C1000 Touch Thermal Cycler</td><td>Amplification PCR</td></tr><tr><td>pDD162 (Peft-3::Cas9 + Empty sgRNA)</td><td>Addgene</td><td>47549</td><td>Expression de Cas9 + sgRNA</td></tr><tr><td>Peptone</td><td>Gibco</td><td>308723</td><td>Composant pour la préparation de plaques d'agar NGM</td></tr><tr><td>Diphosphate de potassium (KH2PO4) </td><td>Sinapharm</td><td>CAS: 7778-77-0</td><td>Composant pour la préparation de plaques d'agar NGM et de tampon M9</td></tr><tr><td>Chlorure de sodium (NaCl)</td><td>Sinapharm</td><td>CAS: 7647-14-5</td><td>Composant pour la préparation de plaques d'agar NGM et de tampon M9</td></tr><tr><td>Stéréomicroscope</td><td>Motic</td><td>K400L</td><td>Choisir et monter les vers sur des tampons d'agarose et effectuer les étapes de récupération post-injection</td></tr></tbody></table>

marquage endogène fluorescent médié par crispr/cas9 des gènes spécifiques à la lignée germinale chez caenorhabditis elegans

CRISPR/Cas9-mediated Endogenous Fluorescent Tagging of Germline-specific Genes in Caenorhabditis elegans

Marquage endogène fluorescent médié par CRISPR/Cas9 des gènes spécifiques à la lignée germinale chez Caenorhabditis elegans

Protein localization in the Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is central to interpreting gene function during gametogenesis, yet conventional ...

crisprcas9-mediated-endogenous-fluorescent-tagging-germline-specific

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La production de C. elegans Les transgènes via Recombineering avec le GalK Marqueurs de sélection

Cette vidéo décrit la microinjection, une méthode courante de création de souches transgéniques de C. elegans. Dans l’exemple, nous verrons la micro-injection utilisée pour introduire un complexe ribonucléoprotéique (RNP) pour l’édition de gènes basés sur CRISPR.

Microinjection de gonades : une méthode d’administration de composés directement dans la lignée germinale de C. elegans

Nous présentons ici une méthode pour l’ingénieur le génome de c. elegans en utilisant CRISPR-Cas9 ribonucléoprotéines et modèles de réparation dépendant d’homologie.

Un rapide et Facile de Pipeline pour générer des Mutants de Point génomique dans c. elegans en utilisant CRISPR/Cas9 ribonucléoprotéines

Ce protocole montre comment suivre une translocation nucléaire de protéines sous la contrainte thermique à l’aide d’une protéine de fusion de protéine (GFP) par fluorescence verte comme un marqueur et 4', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) coloration. Le DAPI souillant le protocole est rapide et préserve les signaux de localisation sous-cellulaire GFP et de protéines.

Détection de protéines localisation subcellulaire par Green Fluorescence marquage de protéines et 4', 6-Diamidino-2-phénylindole coloration chez Caenorhabditis elegans

Décrite ici, c’est un protocole pour le marquage de façon endogène des protéines avec des étiquettes fluorescentes dans les cellules souches humaines pluripotentes induites à l’aide de CRISPR/Cas9 exprimées. Cellules putativement édités sont enrichis en triant les cellules fluorescence activé et lignées clonales sont générées.

Protéine endogène de marquage dans l’homme induites par les cellules souches pluripotentes à l’aide de CRISPR/Cas9

L’objectif de ce protocole est de permettre l’édition CRISPR/Cas9 transparente du génome de C. elegans en utilisant des complexes de ribonucléoprotéines assemblés et le marqueur co-CRISPR dpy-10 pour le dépistage. Ce protocole peut être utilisé pour effectuer une variété de modifications génétiques chez C. elegans, y compris des insertions, des délétions, des remplacements de gènes et des substitutions de codon.

CRISPR/Cas9 Édition du gène C. elegans rbm-3.2 à l’aide du marqueur de criblage co-CRISPR dpy-10 et des complexes de ribonucléoprotéines assemblés.

Ici, nous présentons un protocole simplifié de marquage génétique endogène pour la drosophile, qui utilise une technique basée sur la PCR pour l’identification sans marqueur des modifications génétiques réussies, facilitant le développement de lignées d’inclusion stables.

Stratégie basée sur CRISPR en une étape pour le marquage des gènes endogènes chez Drosophila melanogaster

Ce protocole décrit un test d’interférence de l’ARN et de ChIP pour étudier l’hérédité épigénétique du silençage induit par l’ARNi et des modifications de la chromatine associées chez C. elegans.

Analyse de l’hérédité épigénétique transgénérationnelle chez C. elegans à l’aide d’un rapporteur fluorescent et de l’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP)

L’article décrit l’optimisation des paramètres d’acquisition de la microscopie à fluorescence pour visualiser le transport axonal de cargaisons endogènes marquées à une résolution de neurone unique chez un nématode vivant.

Optimisation de la visualisation du transport axonal de la cargaison endogène par microscopie à fluorescence chez Caenorhabditis elegans vivant

La Biotinylation par illumination restreinte par localisation spécifique à AviTag (ALIBi) est une méthode novatrice activée par l’optogénétique développée pour marquer et purifier par affinité les populations subcellulaires de ribosomes pour le séquençage en aval et l’analyse protéomique.

Isolement des sous-populations de ribosomes subcellulaires basé sur la biotinylation enrichie par éclairage restreinte par peptide peptidique spécifique à la marque de recombinaison

Ici, nous présentons un protocole pour marquer les protéines avec une étiquette de protéine de fluorescence chez les larves de poisson-zèbre, un système in vivo nouvellement développé et modifié particulièrement utile pour visualiser les protéines de faible abondance chez le poisson zèbre.

Marquage par fluorescence pour visualiser les protéines faiblement exprimées chez le poisson-zèbre

Apprenez le marquage endogène fluorescent par CRISPR/Cas9 des protéines germinales chez Caenorhabditis elegans. Ce protocole permet d'obtenir des lignées stables avec expression native pour l'analyse de localisation in vivo.

Marquage endogène fluorescent médié par CRISPR/Cas9 des gènes spécifiques à la lignée germinale chez Caenorhabditis elegans

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