Un protocole rationalisé pour la microscopie de localisation à molécule unique dans les noyaux d’Arabidopsis

Mes recherches portent sur l’édition de l’épigénome et la visualisation de l’organisation de la chromatine dans les noyaux d’Arabidopsis à l’aide de la microscopie à super résolution. Les méthodes existantes ne sont pas adaptées à l’imagerie STORM. Ce protocole améliore la pureté des noyaux, la cohérence du marquage, le montage de l’échantillon et la stabilité de l’imagerie.

Elle s’applique à Arabidopsis thaliana et à d’autres systèmes de plantes pour étudier l’organisation nucléaire, la structure de la chromatine et l’épigénétique à haute résolution. Pour commencer, placez une plaque de culture à six puits sur glace sous la hotte de fumée. Mélangez la solution de fixation contenant 4 % en volume par volume, du formaldéhyde stabilisé au méthanol 0,1 % Triton X100 et PBS.

Ajoutez environ quatre millilitres de solution de fixation glacée dans chaque puits sous la hotte. À l’aide de pinces propres, retirez les semis d’Arabidopsis qui sont compris entre huit et quinze jours après la germination à partir de Murashige et Skoog solides à demi-force, ou milieu MS. Immergez immédiatement les semis dans la solution de fixation et placez environ 20 semis par puits.

Utilisez trois puits pour obtenir suffisamment de matière par échantillon. Placez la plaque dans la chambre à vide remplie de glace et fermez-la. Appliquer un vide en alternant entre moins 0,6 bar et moins 0,8 bar pendant 15 minutes pour éliminer l’air piégé et permettre une pénétration profonde du fixateur dans les tissus végétaux.

Ensuite, relâche lentement l’aspirateur. Mélangez l’échantillon et appliquez le vide pendant 15 minutes supplémentaires. Sous la hotte, retirez la solution de fixation avec une pipette.

Lavez chaque puits trois fois pendant 10 minutes chacune sous une agitation douce avec cinq millilitres de PBS glacé. Après les lavages, retirez le PBS. À l’aide de pinces, transférez le tissu fixé dans une boîte de Petri de 120 par 120 millimètres et ajoutez 50 microlitres de tampon d’isolation des noyaux aux semis fixés.

Avec une lame, coupez le tissu fixe. Avec la même lame, grattez le tissu coupé sur un bord de la boîte de Petri. Ajoutez 600 microlitres de tampon d’isolation des noyaux et lavez tout tissu collé à la lame.

Transférez la boue de tissu dans un tube homogénéisant Dounce de deux millilitres et frottez cinq à dix fois avec le pilon plus petit. Ensuite, il faut caresser avec le pilon plus grand jusqu’à ce qu’il se déplace en douceur à l’intérieur du tube, nécessitant généralement cinq à dix coups. Filtrez l’échantillon homogénéisé à travers un filtre en maille de 30 micromètres dans un tube de 50 millilitres.

Transférez le filtrat dans un tube neuf de 1,5 millilitre. Centrifugez la suspension pendant 10 minutes à 800G en utilisant la rampe la plus basse pour l’accélération et la décélération. Après centrifugation, notez qu’une petite pastille blanche est visible parmi les débris de tissu vert.

Jetez le surnageant et resuspendez la pellete dans 600 microlitres de tampon d’isolation des noyaux. Centrifugez à nouveau pendant 10 minutes à 800G et retirez le surnageant. Après avoir complètement lavé les débris verts, conservez la suspension isolée des noyaux à quatre degrés Celsius pendant une semaine maximale et immunocolorez les noyaux avec les anticorps désirés.

Chauffez la solution d’agarose à faible fondon à 1,5 % en volume à 90 degrés Celsius pendant une minute pour dissoudre la poudre et obtenir une solution claire. Vortex brièvement pour assurer un mélange complet. Refroidissez la solution et maintenez-la à 37 degrés Celsius avant de procéder pour éviter la dénaturation thermique du tampon glucose oxydase.

Après que la solution d’agarose à faible fusion atteigne 37 degrés Celsius, préparez le tampon STORM en ajoutant 100 millimolaires de mercaptoéthylylamine et de tampon de glucose oxydase à l’agarose à faible fusion pour obtenir une concentration finale 1x et mélangez la solution délicatement. Déposez 10 microlitres du mélange de noyaux sur une gaine de couverture de 1,5 h traitée à l’ozone, traitée pendant 20 minutes dans un système de nettoyage à l’ozone ultraviolet. Attendez trois minutes pour permettre aux noyaux de se déposer sur la housse de couverture.

Ensuite, retirez l’excès de liquide et attendez deux minutes. Ajoutez 10 microlitres d’agarose préparée à faible fusion à la barbe de couverture et recouvrez immédiatement avec une lame de microscope. Scellez la gaine de couverture avec un scellant silicone.

Mélangez des quantités égales de solution A et B dans une petite boîte de Petri à l’aide d’une pointe de micropipette. Appliquez le mélange sur les bords de la barbe de couverture pour sceller l’échantillon. Laissez durcir le scellant silicone pendant cinq minutes.

Montez la lame de l’échantillon sur le microscope et trouvez la mise au point. Localiser et se concentrer sur un noyau. Activez un module de maintien de la concentration si disponible afin d’assurer la stabilité lors de longues acquisitions.

Sélectionnez une région où un ou quelques nanodiamants sont positionnés près du noyau pour améliorer la correction de dérive lors de la reconstruction. Pour l’imagerie bicolore, commencez l’acquisition avec le canal de longueur d’onde plus longue puis passez au canal à longueur d’onde plus courte pour compléter l’imagerie. Traiter les piles d’images brutes dans ThunderSTORM en utilisant un ajustement gaussen avec estimation des moindres carrés pondérés et générer des images reconstruites.

Appliquer un filtrage basé sur sigma et incertitude en dessous de 30 nanomètres pour conserver des localisations précises et éliminer le bruit. Enfin, effectuer une correction de dérive d’échantillon en utilisant la corrélation croisée ThunderSTORM ou l’algorithme COMET et confirmer la dérive minimale dans les images reconstruites. Les noyaux ont été isolés à partir de semis sauvages âgés de 15 jours, immunomarqués avec des anticorps secondaires conjugués AF647 et contre-colorés avec Hoechst H33258.

L’imagerie confocale a montré plusieurs noyaux isolés et bien préservés avec un minimum de débris, les chromocentres et le nucléole étant clairement distinguables. Le signal de l’ARN polymérase II était absent des chromocentres et du nucléole. Les projections d’intensité maximale limitées par la diffraction et les reconstructions SMLM correspondantes ont révélé des détails structurels de la polymérase ARN II et du marquage de l’ADN, y compris des régions d’intérêt élargies présentant des structures plus fines.

Le filtrage de localisation basé sur sigma et incertitude a amélioré la définition à la fois des signaux ARN polymérase II et ADN par rapport aux localisations détectées. Et un raffinement supplémentaire après correction de dérive a maintenu cette structure améliorée. Le filtrage basé sur les valeurs sigma supprimait les localisations avec des largeurs ajustées trop petites ou grandes.

L’analyse de corrélation par anneau de Fourier a montré que la résolution du canal AF647 est passée de 90,1 à 47,7 nanomètres après filtrage, tandis que le canal JF549 est passée de 56,6 à 27,9 nanomètres. Maintenir l’intégrité nucléaire tout en minimisant les débris et la fluorescence de fond est essentiel pour obtenir une imagerie moléculaire unique de haute qualité. Des études futures pourront relier l’architecture nucléaire à la régulation des gènes dans des conditions environnementales ou de développement.