Name: Identification des histones modifiées comme substrats de liaison du membre 4 de la famille des spindlines humaines (SPIN4) par des réseaux peptidiques et un pulldown des nucléosomes natifs (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-03-27T14:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: Découvrez l'identification des substrats de liaison de SPIN4 par réseaux peptidiques et pulldown de nucléosomes natifs. Cette méthode permet d'étudier la spécificité de liaison des lecteurs d'histones impliqués dans la régulation de la croissance osseuse.

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<ol><li>Lui, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss-of-function+variant+in+SPIN4+causes+an+X-linked+overgrowth+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Loss-of-function variant in SPIN4 causes an X-linked overgrowth syndrome.</a> JCI Insight. 8 (9), e167074(2023).</li>
<li>Chawla, N., Rajput, M., Shriyan, R., Bachani, S., Gupta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+observation+of+a+rare+Binder+phenotype+with+fetal+overgrowth+due+to+a+SPIN4+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Matern+Fetal+Med%22%5BJournal%5D)">Clinical observation of a rare Binder phenotype with fetal overgrowth due to a SPIN4 mutation.</a> Matern Fetal Med. 7 (1), e0030(2025).</li>
<li>Lu, R., Wang, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tudor%3A+a+versatile+family+of+histone+methylation+readers%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Tudor: a versatile family of histone methylation readers.</a> Trends Biochem Sci. 38 (11), 546-555 (2013).</li>
<li>Ruthenburg, A. J., Li, H., Patel, D. J., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multivalent+engagement+of+chromatin+modifications+by+linked+binding+modules%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Multivalent engagement of chromatin modifications by linked binding modules.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (12), 983-994 (2007).</li>
<li>Mauser, R., Jeltsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+modified+histone+peptide+arrays+in+chromatin+research%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Application of modified histone peptide arrays in chromatin research.</a> Arch. Biochem Biophys. 661, 31-38 (2019).</li>
<li>Hsu, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraspeckle+protein+NONO+regulates+active+chromatin+by+allosterically+stimulating+NSD1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Paraspeckle protein NONO regulates active chromatin by allosterically stimulating NSD1.</a> Cell Rep. 44 (1), 116247(2025).</li>
<li>Hsu, C. I., Yeh, E., Chen, C. C. L., Sahn, M., Yu, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+reconstituting+enzymatic+activities+for+ultra-large+histone+methyltransferases+NSD1+and+SETD2+using+a+baculovirus+expression+system%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol for reconstituting enzymatic activities for ultra-large histone methyltransferases NSD1 and SETD2 using a baculovirus expression system.</a> STAR Protoc. 6 (1), 103963(2025).</li>
<li>Plazas-Mayorca, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-pot+shotgun+quantitative+mass+spectrometry+characterization+of+histones%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">One-pot shotgun quantitative mass spectrometry characterization of histones.</a> J Proteome Res. 8 (11), 5367-5374 (2009).</li>
<li>Fuhrmann, J., Thompson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+arginine+methylation+and+citrullination+in+epigenetic+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Protein arginine methylation and citrullination in epigenetic regulation.</a> ACS Chem Biol. 11, 654(2015).</li>
<li>Zhao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+for+histone+H3+%E2%80%9CK4me3-K9me3%2F2%E2%80%9D+methylation+pattern+readout+by+Spindlin1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Molecular basis for histone H3 “K4me3-K9me3/2” methylation pattern readout by Spindlin1.</a> J Biol Chem. 295 (49), 16877(2021).</li>
<li>Padeken, J., Methot, S. P., Gasser, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+H3K9-methylated+heterochromatin+and+its+functions+in+tissue+differentiation+and+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Establishment of H3K9-methylated heterochromatin and its functions in tissue differentiation and maintenance.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 23 (9), 623-640 (2022).</li>
<li>Greschik, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histone+code+reader+Spin1+controls+skeletal+muscle+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">The histone code reader Spin1 controls skeletal muscle development.</a> Cell Death Dis. 8 (11), e3173(2017).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Tubes microcentrifuges de 1,5 mL</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.001</td><td>Expériences générales</td></tr><tr><td>Plat de culture tissulaire de 15 cm</td><td>Sarstedt</td><td>83.3903.300</td><td>Expériences générales</td></tr><tr><td>Tubes centrifugeuses coniques de 15 mL</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.101</td><td>Expériences générales</td></tr><tr><td>Tubes centrifugeuses coniques de 50 mL</td><td>Sarstedt</td><td>62.548.004</td><td>Expériences générales</td></tr><tr><td>Flasque Erlenmeyer de 500 mL</td><td>Stellar Scientific</td><td>CT229809</td><td>Culture cellulaire Sf9</td></tr><tr><td>Imageur CCD Amersham ImageQuant 800</td><td>Cytiva</td><td>IMQ800</td><td>Système d’imagerie CCD</td></tr><tr><td>Gel d’affinité anti-FLAG M2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2220</td><td>Pulldown biochimique</td></tr><tr><td>Anticorps anti-FLAG M2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1804</td><td>Tache occidentale</td></tr><tr><td>Aprotinine</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-P0017</td><td>Inhibiteur de la protéase</td></tr><tr><td>Array Analyze Sofrware</td><td>Motif actif</td><td>https://www.activemotif.com/documents/Array_Analyze_Software_v16.1.zip</td><td>Analyse de données de matrices peptidiques MODified</td></tr><tr><td>ASI Agarose LE</td><td>Alkali Scientific</td><td>A7700</td><td>Gel ADN</td></tr><tr><td>Système d’expression du baculovirus Bac-to-Bac</td><td>Thermo Scientific</td><td>10359016</td><td>Expression baculovirale</td></tr><tr><td>Chlorhydrate de benzamidine</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-W018781</td><td>Inhibiteur de la protéase</td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647</td><td>Norme de quantification des protéines</td></tr><tr><td>Bromophénol Blue</td><td>Thermo Scientific</td><td>A18469.08</td><td>Tampon de Lammeli</td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td><td>Thermo Scientific</td><td>20278</td><td>Coloration en gel Protien</td></tr><tr><td>Dithiothréitol (TDT)</td><td>Sigma-Aldrich & nbsp ;</td><td>D5545</td><td>Tampon de lyse</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Produits de recherche RPI</td><td>E58100</td><td>Tampon de lyse</td></tr><tr><td>Substrat à chimiluminescence améliorée (ECL)</td><td>Cytiva</td><td>RPN2232</td><td>Tache occidentale</td></tr><tr><td>Milieu de culture cellulaire d’insectes ESF 921</td><td>Systèmes d’expression</td><td>96-001</td><td>Culture cellulaire Sf9</td></tr><tr><td>Éthanol (200 proof)</td><td>Chemical du spectre</td><td>ET107</td><td>Précipitation de l’ADN</td></tr><tr><td>Système d’imagerie EVOS M5000</td><td>Invitrogen</td><td>M5000</td><td>Imagerie générale</td></tr><tr><td>Peptide FLAG</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-P7006</td><td>Élution par pulldown</td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Sigma-Aldrich & nbsp ;</td><td>G77893</td><td>Tampon de stockage</td></tr><tr><td>Anticorps H3K4me1 &nbsp ;</td><td>Motif actif</td><td>39300</td><td>Tache occidentale</td></tr><tr><td>Anticorps H3K4me2 &nbsp ;</td><td>Signalisation cellulaire</td><td>9725T</td><td>Tache occidentale</td></tr><tr><td>Anticorps H3K4me3 & nbsp ;</td><td>Signalisation cellulaire</td><td>9751T</td><td>Tache occidentale</td></tr><tr><td>HEK293FT cellules</td><td>Thermo Scientific</td><td>R70007</td><td>Lignée de fibroblasts rénaux embryonnaires humains</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich & nbsp ;</td><td>H3375</td><td>Tampon de lyse</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>Instituts nationaux de la santé</td><td>https://imagej.net/ij/download.html</td><td>&nbsp ; Programme de traitement d’image basé sur Java</td></tr><tr><td>Hémisulfate de leupeptine</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-18234A</td><td>Inhibiteur de la protéase</td></tr><tr><td>Nucléase microcoque (MNase)</td><td>NEB&nbsp ;</td><td>M0247S</td><td>Endonucléase pour la digestion de la chromatine</td></tr><tr><td>Modèle 120 Sonic Dismembrator</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB120110</td><td>Sonication</td></tr><tr><td>Réseau peptidique d’histones MODified</td><td>Motif actif</td><td>13005</td><td>Dosage de liaison aux protéines</td></tr><tr><td>Pepstatine A</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-P0018</td><td>Inhibiteur de la protéase</td></tr><tr><td>Fraction d’IgG de peroxydase IgG monoclonale de chèvre anti-souris, spécifique à la chaîne légère</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-035-174</td><td>Tache occidentale</td></tr><tr><td>pFastBac1-Flag-SPIN4</td><td>Thermo Scientific</td><td>10360014</td><td>Vecteur d’expression baculoviral</td></tr><tr><td>pFastBac1-Drapeau-SPIN4-D82H</td><td>Thermo Scientific</td><td>10360014</td><td>Vecteur d’expression baculoviral</td></tr><tr><td>Phénol : Chloroforme : Alcool isoamylique (25:24:1)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2069</td><td>Purification de l’ADN</td></tr><tr><td>Kit de test protéique Pierce Rapid Gold BCA</td><td>Thermo Scientific</td><td>PIA53226</td><td>Quantificaiton protéique</td></tr><tr><td>Kit de teinture Pierce Silver</td><td>Thermo Scientific</td><td>24612</td><td>Détection des protéines</td></tr><tr><td>Inhibiteur de la protéase PMSF</td><td>Thermo Scientific</td><td>36978</td><td>Inhibiteur de la protéase</td></tr><tr><td>Polyacrylamide Gel</td><td>Fabriqué en interne</td><td>N/A</td><td>Gel protéique</td></tr><tr><td>Cellules d’insectes Sf9</td><td>ATCC</td><td>CRL-1711</td><td>Lignée cellulaire d’insectes pour l’expression du baculovirus</td></tr><tr><td>Dispositif de dialyse Slide-A-Lyzer MINI, MWCO 10K</td><td>Thermo Scientific</td><td>69572</td><td>Dialyse des protéines</td></tr><tr><td>Acétate de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8750</td><td>Précipitation de l’ADN</td></tr><tr><td>Chlorure de sodium & nbsp ;</td><td>Fischer&nbsp ;</td><td>BP358-1</td><td>Tampons généraux</td></tr><tr><td>Dodécyle sulfate de sodium (SDS)</td><td>Sigma-Aldrich & nbsp ;</td><td>L3771</td><td>Tampons généraux</td></tr><tr><td>Solution bleue de Trypan (0,4 %)</td><td>Thermo Scientific</td><td>15250061</td><td>Coloration des noyaux</td></tr></tbody></table>

identification des histones modifiées comme substrats de liaison du membre 4 de la famille des spindlines humaines (spin4) par des réseaux peptidiques et un pulldown des nucléosomes natifs

Identification of Modified Histones as Binding Substrates of Human Spindlin Family Member 4 (SPIN4) by Peptide Arrays and Native Nucleosome Pulldown

Identification des histones modifiées comme substrats de liaison du membre 4 de la famille des spindlines humaines (SPIN4) par des réseaux peptidiques et un pulldown des nucléosomes natifs

Human Spindlin Family Member 4 (SPIN4) has just emerged as a novel regulator of bone growth. Loss-of-function variants in SPIN4 were identified in ...

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Les progrès de la spectrométrie de masse ont permis l'analyse à haut débit de l'expression protéique et la modification dans une multitude de tissus. Combiné avec fractionnement subcellulaire et modèles de maladies, spectrométrie de masse quantitative et de la bioinformatique peut révéler de nouvelles propriétés dans les systèmes biologiques. Le procédé décrit ici analyse des protéines associées à la chromatine dans le cadre d'une maladie cardiaque et est facilement applicable à...

Analyse quantitative des Protéomes chromatine dans la maladie

En combinant natif et réticulation immunoprécipitation de la chromatine à haute résolution de spectrométrie de masse, l'approche ChroP permet de disséquer l'architecture protéomique composite de modifications des histones, des variantes et des protéines non-histoniques synergie au domaines de la chromatine fonctionnellement distinctes.

L&#39;approche ChroP Combine puce et la spectrométrie de masse à Disséquer protéomiques paysages Locus spécifiques de la chromatine

Dans ce protocole, nous décrivons une nouvelle technique BrdU-ChIP-Slot-Western pour examiner les protéines et les modifications d’histones associées à l’ADN nouvellement synthétisé ou naissant.

Examen des protéines liées à Nascent ADN dans les cellules de mammifères utilisant la technique BrdU-Chip-Slot-Ouest

Ce protocole décrit un flux de travail entièrement intégrée pour caractériser histone modifications post-traductionnelles par spectrométrie de masse (MS). Le flux de travail comprend histone purification à partir de cultures de cellules ou de tissus, histone dérivatisation et la digestion, l'analyse de MS en utilisant la chromatographie et des instructions pour l'analyse des données de liquide nano-flux. Le protocole est conçu pour l'achèvement dans les 2 - 3 jours.

Flux de travail complet pour l&#39;analyse des histones modifications post-traductionnelles utilisant la spectrométrie de masse Bottom-up: De Histone Extraction à l&#39;analyse des données

Ce protocole décrit la reconstitution de nucléosomes contenant différentiellement histones sœurs marqués d'un isotope. Dans le même temps, les nucléosomes asymétriquement modifications post-traductionnelles peuvent être générés après l'utilisation d'une copie préalablement modifiée de l'histone. Ces préparations peuvent être facilement utilisés pour étudier les mécanismes de modification de diaphonie, simultanément sur les deux histones sœurs, en utilisant la spectroscopie de RMN à haute...

Reconstitution de nucléosomes avec histones soeurs Différentiellement Isotope marqués

Ce manuscrit décrit des méthodes pour l'application de la technologie des micro-aigres peptidiques au profilage spécifique des anticorps qui reconnaissent les histones et leurs modifications post-traductionnelles.

Analyse de la spécificité d&#39;anticorps d&#39;histone avec des microarrays de peptides

Nous décrivons ici un protocole pour l’immunoprécipitation de la chromatine des histones modifiées de la levure Saccharomyces cerevisiae. ADN immunoprécipitée est ensuite utilisé pour la PCR quantitative pour interroger l’abondance et la localisation des modifications post-traductionnelles des histones dans tout le génome.

Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) des Modifications d’Histone de Saccharomyces cerevisiae

Ce protocole décrit une batterie de méthodes qui comprend la chromatographie analytique taille-exclusion pour étudier l’oligomérisation et la stabilité des histones chaperones, le test pull-down pour démêler les interactions hiperon-histone, l’ASC pour analyser la stœchiométrie des complexes protéiques et le test de chaperonnage des histones pour caractériser fonctionnellement un chaperon histones putatif in vitro.

In vitro Caractérisation des chaperons de histones à l’aide d’essais analytiques, de rabattement et de chaperoning

Un flux de travail analytique basé sur la chromatographie liquide, la spectrométrie de mobilité des ions piégés et la spectrométrie de masse à temps de vol (LC-TIMS-TOF MS/MS) pour une analyse ascendante hautement fiable et hautement reproductible des modifications et de l’identification des histones en fonction des principaux paramètres (temps de rétention [RT], section efficace de collision [CCS] et rapport masse/charge précis [m/z]).

Criblage de modification des histones par chromatographie liquide, spectrométrie de mobilité des ions piégés et spectrométrie de masse à temps de vol

Cet article présente une procédure expérimentale détaillée pour reconstituer des attaches d’ADN contenant des nucléosomes pour la microscopie à force corrélative et à fluorescence à molécule unique. Il décrit en outre plusieurs expériences en aval qui peuvent être menées pour visualiser le comportement de liaison des protéines interagissant avec la chromatine et analyser les changements dans les propriétés physiques des nucléosomes.

Assemblage de nucléosomes in situ pour la microscopie à force corrélative et à fluorescence d’une molécule unique

L’enrichissement et le séquençage de l’ADN naissant associé aux protéines (eSPAN) ont été développés pour détecter l’abondance relative d’une protéine associée à la chromatine sur deux brins d’ADN réplicatifs, révélant ainsi une compréhension moléculaire de la réplication de la chromatine et de ses processus couplés. Ce protocole décrit les procédures eSPAN chez les cellules souches embryonnaires (ES) de levure et de souris.

Analyse spécifique des brins des protéines lors de brins d’ADN réplicatifs par enrichissement et séquençage de la méthode de l’ADN naissant associé aux protéines

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