Une méthode optimisée pour isoler l’épithélium urétral chez la souris femelle pour l’analyse unicellulaire et immunofluorescence

Notre groupe s’intéresse à l’étude du motif épithélial dans le tube génito-urinaire. Ce protocole représente une méthode optimisée pour isoler la muqueuse épithéliale de l’urètre de la femelle souris pour une analyse moléculaire et cellulaire en aval. Les méthodes décrites dans cet article aideront à la recherche sur la muqueuse urétrale féminine et son rôle dans la défense immunitaire.

Pour commencer, placez la souris euthanasiée du CD1, âgée de 6 à 12 semaines, en position couchée sur la table de dissection. Vaporisez 70 % d’éthanol sur l’abdomen pour mouiller les cheveux. Avec une pince, soulevez la peau de l’abdomen.

Ensuite, avec de petits ciseaux, faites une incision verticale vers le bas du corps, en terminant à l’ouverture urétrale externe. Identifiez la vessie et soulevez-la doucement avec une pince, en veillant à ce qu’elle soit vide et sans urine. À l’aide de ciseaux, coupez la graisse et le tissu conjonctif autour de la vessie pour exposer la structure en forme de papillon où les deux os pubiens se rejoignent à la symphyse pubienne.

Observez l’urètre qui passe sous la symphyse pubienne. Ensuite, soulevez la symphyse pubienne avec des pinces et ouvrez-la avec des ciseaux. Retirez les fragments d’os pubiens pour exposer l’urètre fin situé sur la surface ventrale de la paroi vaginale.

À l’aide de pinces fines, tirez doucement la vessie vers le haut depuis la cavité corporelle. Faites passer des ciseaux entre l’urètre et la paroi vaginale pour séparer les voies urinaire et reproductrice. Maintenez une légère tension sur la vessie tout en coupant le long de l’arrière de l’urètre pour la séparer de la paroi vaginale.

Continuez à couper jusqu’à l’ouverture urétrale distale pour obtenir l’urètre de souris de pleine longueur, mesurant de 1,2 à 1,5 centimètre de long. Ensuite, séparez l’urètre de la vessie en effectuant une seule coupure au niveau du col de la vessie. Concentrez quatre à cinq uretras dans une boîte de Petri stérile contenant du HBSS frais, sans calcium ni magnésium.

Au microscope disséqueur, coupez la graisse et le tissu conjonctif entourant l’urètre à l’aide de pinces fines et de ciseaux. Ensuite, avec des ciseaux, coupez chaque urètre en travers en deux morceaux de taille égale. Placez les morceaux de mouchoir sur une tamis en nylon de 100 microns.

Lavez les morceaux de tissu avec un millilitre de HBSS, puis transférez-les dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre contenant un millilitre de 1 % de tripsine préparé en HBSS complété avec antibiotiques et antimicotiques. Ensuite, incubez l’échantillon sur un rotateur à 30 tours par minute et à quatre degrés Celsius pendant 15 à 30 minutes. Après la digestion, ajoutez 10 millimolaires de chlorure de magnésium préparé en HBSS dans le tube, suivis de 10 microgrammes par millilitre d’ADNase préparée dans le PBS.

Incubez le tube pendant 15 à 30 minutes sur un rotateur placé dans un four d’hybridation à 37 degrés Celsius. Pour tremper la trypsine, transférez les tissus urétraux dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre contenant 10 % de sérum de mouton dans du HBSS à température ambiante. Après cinq minutes, transférez les tissus urétraux dans un nouveau tube contenant du HBSS glacé, puis dans une boîte de Petri stérile contenant du HBSS glacé.

Lors de l’observation de l’échantillon au microscope, tenez une extrémité de la pièce urétrale avec une pince. À l’aide d’une autre paire de pinces, passez le long de toute la longueur de la pièce urétrale pour extruder la feuille épithéliale transparente. Traiter directement certains des feuillets épithéliaux urétrales isolés pour une immunocoloration totale afin de visualiser les cellules épithéliales et les macrophages associés à l’épithélium in situ.

Utilisez une petite pipette en plastique pour transférer les morceaux épithéliaux dans une goutte de HBSS isolée de quatre à cinq urètres de souris regroupées dans une boîte de Petri stérile. Utilisez des ciseaux pour réduire l’épithélium en petits fragments. Transférez les fragments épithéliaux hachés dans un tube de microcentrifuge de deux millilitres contenant 1,5 millilitre de solution digestive préchauffée à Accutase à 37 degrés Celsius.

Incubez l’échantillon sur un rotateur à 37 degrés pendant une heure. Après l’incubation, transférez l’intégralité du contenu dans un tube centrifugeuse de cinq millilitres contenant deux millilitres de tampon de lavage composé de 1X PBS sans calcium ni magnésium et 1 % BSA. Centrifugez la suspension à 600 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius à l’aide d’un rotor à seau pivotant.

Ensuite, aspirez le surnageant à l’aide d’un vide doux. Ensuite, utilisez une pipette à embout filtrante d’un millilitre pour resuspendre le pellet dans un millilitre de tampon de lavage. Séparez la pellete en pipettant de haut en bas jusqu’à ce que les amas deviennent plus petits.

Faites passer la suspension à travers des aiguilles de calibre 23,5 et 26,5, chacune attachée à une seringue d’un millilitre en utilisant quatre courses par aiguille. Ensuite, ajoutez un millilitre de tampon de lavage pour humidifier la surface d’un filtre de préséparation de 30 microns placé sur un tube de cinq millilitres. En utilisant la seringue reliée à l’aiguille de calibre 26,5, transférez un millilitre de la suspension cellulaire à travers le filtre.

Ensuite, lavez le tube avec un millilitre de tampon de lavage et passez-le dans le filtre. Pelletez les cellules par centrifugation à 600 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius à l’aide d’un rotor à godet pivotant. Aspirez le surnageant.

Résuspendez la pellete dans 100 microlitres de tampon de lavage et ajoutez 100 microlitres de tampon de lyse des globules rouges. Après exactement trois minutes, ajoutez quatre millilitres de tampon de lavage et mélangez. Récoltez les cellules par centrifugation à 600 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius à l’aide d’un rotor de seau pivotant.

Retirez le surnageant avant de resuspendre le pellet dans 50 à 200 microlitres de tampon de lavage selon la taille du pellet. Mélangez une aliquote de cellules de cinq microlitres avec cinq microlitres de bleu de trypane et chargez le mélange sur un hémocytomètre pour évaluer le rendement cellulaire et la viabilité. Évaluer la viabilité cellulaire et quantifier les populations cellulaires distinctes à l’aide de la cytométrie en flux.

Cultivez des cellules épithéliales urétrales uniques dans une matrice membranaire basale et un milieu d’expansion organoïde pour générer des organoïdes épithéliaux urétrales tridimensionnels. Effectuer une coloration par hématoxyline à l’éosine et une immunocoloration fluorescente sur des sections organoïdes intégrées afin de visualiser la structure organoïde et la composition cellulaire. Les gaines épithéliales urétrales isolées présentaient une transparence plus élevée que le tissu stromal après séparation.

L’immunocoloration complète des gaines épithéliales a montré un marquage fort avec l’anticorps E-cadherin CDH1. Le marquage des feuilles avec l’anticorps contre F480 a montré que les macrophages formaient des structures dendritiques ramifiées entre les cellules épithéliales de l’urètre. Les cellules isolées de l’épithélium urétral ont montré une viabilité constamment élevée par exclusion du bleu de trypan sur un hémocytomètre et une cytométrie en flux utilisant le colorant fantôme réactif à l’amine V 450.

Les cellules isolées contenaient une population cellulaire épithéliale enrichie après l’activation des cellules vivantes. Environ 1,3 % des cellules immunitaires CD45 positives et 1,18 % de macrophages ont été observés dans les suspensions unicellulaires. Des cellules épithéliales isolées de l’urètre sont restées viables et ont formé des organoïdes dans une matrice tridimensionnelle, avec une croissance organoïde observée jusqu’au sixième jour en culture.

La coloration à l’éosine par hématoxyline a montré deux morphologies distinctes des organoïdes épithéliaux urétraux, incluant de grands organoïdes creux et des organoïdes solides plus petits. Les organoïdes épithéliaux urétrales creux et solides étaient stratifiés et exprimaient KRT5 et P63 dans la couche basale. Ils ont exprimé KRT-13 dans les couches cellulaires suprabasales et intermédiaires.

Les organoïdes générés par l’urètre proximal présentaient une proportion plus élevée d’organoïdes creux tandis que ceux de l’urètre distal formaient des sphères plus solides. Ce protocole permet aux chercheurs d’étudier les types de cellules urétrales et la capacité d’auto-renouvellement des cellules épithéliales depuis l’urètre proximal et distal. L’une des considérations les plus importantes de ce protocole est la dissection minutieuse de l’urètre de pleine longueur et une digestion enzymatique optimale afin d’obtenir des cellules épithéliales urétrales viables pour une analyse en aval.

Les cellules épithéliales produites par ce protocole peuvent être utilisées pour de multiples applications, notamment le séquençage à ARN unicellulaire, le séquençage d’ARN en masse, la cytométrie en flux, l’immunocoloration et la culture d’organoïdes.