Une méthode intégrée pour la modélisation photothrombotique de l’AVC et l’enregistrement in vivo des optrodes de l’activité neuronale et astrocytaire chez des souris en comportement

Notre recherche développe une méthode intégrée permettant d'enregistrer simultanément l'activité des astrocytes et des neurones pendant un accident vasculaire cérébral ischémique chez des souris en activité. Les méthodes antérieures enregistraient les neurones ou les astrocytes séparément. Notre protocole permet de capturer simultanément les signaux des astrocytes et des neurones dès les premiers instants du début de l'accident vasculaire.

Pour commencer, transférez une souris C57BL/6J profondément anesthésiée vers le cadre stéréotaxique équipé d’un masque d’anesthésie. Surveillez la profondeur de l’anesthésie toutes les 10 minutes tout en maintenant la température corporelle de la souris entre 36 et 37,5 degrés Celsius à l’aide d’un tapis chauffant à commande rétroactive. Fixez la souris au cadre stéréotaxique à l’aide de barres auriculaires et d’une barre buccale après avoir appliqué une pommade ophtalmique sur les yeux.

Confirmez l'immobilisation de la tête par un sondage doux une fois que la tête est fixée de manière symétrique. Après épilation et une préparation cutanée aseptique, utilisez des ciseaux chirurgicaux pour pratiquer une incision médiane. Nettoyez le périoste avec du sérum physiologique et des cotons-tiges afin d'exposer le bregma et le lambda.

Abaisser la micropipette en verre pour toucher successivement le bregma et le lambda. Après avoir noté la coordonnée Z sur le pied à coulisse numérique, ajuster la barre buccale jusqu'à ce que la différence soit inférieure à 0,04 millimètre. Abaisser la micropipette en verre pour toucher le bregma et réinitialiser le pied à coulisse numérique à zéro.

Déplacez la micropipette de 2,3 millimètres successivement vers la gauche et vers la droite par rapport au bregma. Après avoir noté la coordonnée Z, ajustez les barres auriculaires jusqu'à ce que les différences bilatérales soient inférieures à 0,04 millimètre. Après avoir réinitialisé le vernier numérique à zéro au niveau du bregma, marquez la zone du cortex moteur du membre antérieur à +1,5 millimètre antéro-postérieur et +0,74 millimètre médio-latéral.

Utilisez un microforet et des forets de 0,5 millimètre à extrémité ronde pour percer un petit trou d’environ 0,5 millimètre de diamètre à l’emplacement marqué. Avant le chargement, mélangez les deux vecteurs viraux adéno-associés en volumes égaux et centrifugez brièvement l’échantillon. Abaissez la micropipette en verre reliée à la pompe de microinfusion jusqu’au site cible à une profondeur dorso-ventrale de -0,94 millimètre par rapport à la surface du cerveau.

Infuser 400 nanolitres du mélange viral contenant 200 nanolitres de chaque vecteur à raison de 50 nanolitres par minute. Retirer lentement la pipette 10 minutes après la fin de l'infusion. Suturer le cuir chevelu avec un fil 4-0 de 20 millimètres, courbe 3/8, puis placer la souris sur un tapis chauffant jusqu'à récupération complète.

Trois à quatre semaines après l'injection virale, suivre la procédure précédemment décrite jusqu'à l'incision du cuir chevelu. Pendant l'incision du cuir chevelu, retirer un carré de 1,5 centimètre sur 1,5 centimètre de cuir chevelu tout en conservant suffisamment de peau autour des yeux. Nettoyer le crâne avec du peroxyde d'hydrogène et du sérum physiologique à 0,9 %.

Après avoir identifié la bregma, réinitialisez le vernier numérique à zéro. Utilisez un foret à pointe ronde de 0,8 millimètre pour légèrement rugosifier la surface du crâne. Marquez la zone du cortex moteur du membre antérieur.

À 1,5 millimètre antéro-postérieur et 0,74 millimètre médio-latéral. Utilisez cette marque comme point central pour dessiner un carré de cinq millimètres sur cinq millimètres. Utilisez une microfraise à environ 10 000 tours par minute pour tracer le carré.

Appliquez continuellement de la solution saline glacée sur le trajet de perçage et arrêtez immédiatement si le lambeau osseux se desserre. Percez trois petits trous de 0,5 millimètre de diamètre sur l'hémisphère controlatéral et le cervelet. Implantez des vis de cranioplastie dans les trous.

Veillez à ce que chaque vis atteigne la dure-mère sans pénétrer plus profondément afin d'éviter tout dommage au tissu cérébral. Utilisez une pince pour retirer le lambeau osseux desserré. Utilisez une pince ultrafine dont la pointe mesure moins de 0,03 millimètre sur 0,01 millimètre pour retirer la dure-mère au niveau de la fenêtre crânienne, en évitant tout contact direct avec le tissu cérébral.

Fixer l'optrode au bras du micromanipulateur du cadre stéréotaxique et la déplacer au-dessus de la fenêtre crânienne. Entrelacer solidement les fils argentés de masse et de référence de l'optrode aux trois vis de cranioplastie. Nettoyer la surface de la fenêtre crânienne avec du sérum physiologique stérile.

Abaisser lentement l'optrode à la profondeur dorso-ventrale souhaitée de moins 0,94 millimètre à raison d'un millimètre toutes les 10 secondes. Appliquer une couche d'agarose sur la fenêtre crânienne après l'implantation. Appliquer trois à quatre couches de ciment dentaire.

Une fois que le ciment dentaire est solidifié, administrer une analgésie pendant trois à cinq jours et laisser la souris se remettre pendant une à deux semaines. Utiliser un système de photométrie par fibre à longueurs d'onde double ou triple pour exciter la GCaMP6s. Régler le canal de signal sur 470 nanomètres et le canal de contrôle sur 410 nanomètres.

Réglez la fréquence d'échantillonnage à 60 images par seconde. À présent, reliez correctement à la terre tous les composants du système d'enregistrement. Utilisez une référence médiane commune pendant l'enregistrement.

Vérifiez que les signaux à large bande et les potentiels de champ locaux sont sélectionnés dans le logiciel d'enregistrement, tout en surveillant le bruit pendant toute la durée de la session d'enregistrement. Après avoir anesthésié brièvement la souris, reliez l'optrode à la ligne d'enregistrement à l'aide d'un adaptateur. Placez la souris dans un environnement semblable à sa cage d'habitation pour l'enregistrement.

Prévoir 10 minutes d'acclimatation après le réveil. Enregistrer la souris lors du test de force de préhension, en effectuant une traction par minute pendant cinq minutes. Horodater précisément les tests comportementaux dans les systèmes multicanal et de photométrie par fibre.

Administrer une solution de colorant Rouge Bengal à 1,5 % par voie intrapéritonéale à raison de 10 à 20 milligrammes par kilogramme et attendre cinq minutes. Connecter la sonde optrode à la source laser une fois l'anesthésie profonde atteinte et maintenue. Appliquer un faisceau laser de 530 nanomètres à 15 milliwatts à travers l'optrode implantée pendant cinq à huit minutes afin d'induire une ischémie focale.

Pour effectuer une stimulation optogénétique, connectez le stimulateur laser à l'optrode. Allumez le stimulateur laser optogénétique de 488 nanomètres et réglez-le à 10 milliwatts pendant cinq minutes pour Opto-vTrap. Enfin, placez la souris sur un tapis chauffant pour la récupération.

Par rapport à la ligne de base, le débit sanguin cérébral a diminué après la photothrombose et est resté réduit à un jour et sept jours après l'accident vasculaire cérébral. La force de préhension des membres antérieurs a montré une diminution très significative à un jour et est restée réduite à sept jours après l'accident vasculaire cérébral. Les transitoires calciques astrocytaires enregistrés par photométrie de fibre et les potentiels d'action neuronaux provenant de l'électrophysiologie ont été alignés en fonction des horodatages.

Après un accident vasculaire cérébral photothrombotique, les fréquences de décharge étaient significativement réduites à la fois chez les neurones pyramidaux et les interneurones, par comparaison avec la fréquence de décharge de base observée lors de la tâche de préhension du membre antérieur. Au moment du préréglage, les transitoires calciques astrocytaires atteignaient leur maximum entre quatre et six secondes après le début de la tâche. Toutefois, l'amplitude était significativement diminuée après l'accident vasculaire cérébral photothrombotique, reflétant une activité calcique affaiblie.

Les graphiques en raster et les histogrammes péri-stimulus ont montré des modifications de l'activité neuronale pendant la stimulation optique. Les fréquences de décharge des neurones pyramidaux et des interneurones ont toutes deux diminué de manière significative après la stimulation optique par rapport à la ligne de base pré-stimulus, confirmant qu'une modulation des astrocytes a un effet mesurable en aval sur l'excitabilité du circuit local. Ce protocole permet un enregistrement ininterrompu de l'exercice et de la neuroactivité tout au long de la période précédant l'accident vasculaire cérébral, depuis la phase aiguë jusqu'au stade chronique.

Le succès de ce protocole repose sur un alignement précis ou coordonné. L’implantation optogénétique monoculaire et une expression virale suffisante sont nécessaires tout au long des interventions chirurgicales. De futures études pourraient utiliser plusieurs implants afin de surveiller des régions cérébrales plus étendues ou cibler différents types cellulaires à l’aide de divers tests comportementaux.