Un système microfluidique pour modéliser le dysfonctionnement endothélial sous contrainte physiologique de cisaillement pulsatile combinée et hyperglycémie oscillatoire

Cette étude étudie comment l’hyperglycémie oscillatoire synchronisée et la contrainte de cisaillement pulsatile entraînent ensemble un dysfonctionnement endothélial dans les maladies vasculaires diabétiques. Les modèles existants utilisent un taux de glucose élevé de départ ou un flux laminaire constant. Nous étudions comment la contrainte de cisaillement pulsatile contrebalance-là la lésion du glucose oscillatoire.

Pour commencer, utilisez un logiciel de conception assistée par ordinateur pour concevoir la structure de la puce microfluidique. Fabriquez le moule maître du SU-8 via une entreprise commerciale. Dans une tasse de mélange propre, mélangez l’agent polydiméthylsiloxane et le prépolymère à un ratio de 10:1 en poids, puis remuez vigoureusement le mélange à la main pendant cinq minutes.

Ensuite, placez le récipient dans une chambre à vide à une pression de 0,08 mégapascal pendant au moins 15 minutes pour éliminer les bulles d’air piégées lors du mélange. Verser le polydiméthylsiloxane sur la plaquette placée dans une boîte de Petri en verre. Dégazez le polydiméthylsiloxane versé sur la plaquette dans un dessiccateur pendant 15 minutes supplémentaires afin d’éliminer les bulles formées lors de la coulée.

Placez la boîte de Petri contenant le moule et le polymère dans un four chaud réglé à 80 degrés Celsius pendant deux heures. À l’aide d’un scalpel, décollez soigneusement la dalle de polymère solidifiée du moule maître. À l’aide d’un outil de perforation à noyau, créez des orifices d’entrée et de sortie aux extrémités désignées des canaux sur la dalle polymère.

Nettoyez la barbe de verre et la face à motifs de la dalle polymère avec du ruban adhésif. Ensuite, traitez à la fois la dalle polymère et la barbe de verre avec un nettoyant plasma à 65 watts sous l’air ambiant pendant 60 secondes. Alignez immédiatement la face du canal polymère avec le côté traité de la barbotine du couvercle en verre.

Ensuite, appuyez doucement pour créer un canal microfluidique fermé de façon permanente. Placez la puce microfluidique liée dans une bouteille en verre boronisé remplie d’eau déionisée. Stérilisez en autoclavant à 121 degrés Celsius et 15 livres par pouce carré pendant 20 minutes.

Placez la puce stérilisée dans un bol de culture de 60 millimètres rempli d’un mélange équimolaire de PBS et de DMEM à faible glucose. Ensuite, à l’aide d’une seringue d’un millilitre, introduisez 100 microgrammes par millilitre de fibronectine dans le canal et faites éclore à 37 degrés Celsius pendant quatre heures. Ensuite, ajoutez 24,5 millimolaires de démanitol à un DMEM hypoglycémique pour augmenter la pression osmotique.

Ajoutez cinq millimolaires de D-glucose à un taux élevé de glucose DMEM pour obtenir une concentration finale de 30 millimolaires de glucose. Préparez un milieu de culture glucose normal et un milieu de culture de glucose élevé, complétés avec 20 % de FBS et 1 % de pénicilline streptomycine. Ensuite, chauffez du PBS, de la trypsine (drys), un milieu de culture glucose normal et un milieu de culture à haute glycémie dans un bain-marie à 37 degrés Celsius.

Prélèvez les cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine dans la boîte de culture à 90 % de confluence. Détacher les cellules à l’aide d’une solution à 0,25 % de trypsine-EDTA. Après avoir incubé les cellules à 37 degrés Celsius pendant 30 secondes, comptez les cellules prélevées et résuspendez-les séparément dans un glucose normal et un milieu glucose élevé à une concentration de 1 fois 10 à la puissance de 6 cellules par millilitre.

À l’aide d’une seringue d’un millilitre, injectez 100 microlitres de la suspension cellulaire dans l’orifice d’admission de la puce microfluidique avec un milieu glucose normal pour le groupe témoin et un milieu à haute glycémie pour le groupe expérimental. Placez les puces microfluidiques dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant 48 heures. Calculez le débit nécessaire pour atteindre la contrainte de cisaillement pulsatile cible à l’aide de l’équation présentée.

Connectez la source de pression au régulateur de pression. Ensuite, reliez le contrôleur de pression au contrôleur de vannes connecté à l’ordinateur pour un contrôle automatisé des formes d’onde de pression. Remplissez deux réservoirs de 100 millilitres, l’un avec un milieu de culture glucose normal et l’autre avec un milieu de culture à haute teneur en glucose.

Reliez les réservoirs aux canaux correspondants du contrôleur de pression. Ensuite, relie les réservoirs et la vanne magnétique à trois voies à deux positions à l’aide de tubes en silicone. Fixez la contrainte de cisaillement pulsatile physiologique cible correspondant à un débit d’environ 200 microlitres par minute.

Programmer la pompe à air programmable pour générer une fonction d’onde sinusoïdale afin de maintenir la contrainte de cisaillement pulsatile. Ensuite, programmez le contrôleur de valve pour qu’il change de canal toutes les cinq minutes afin de générer une oscillation de glucose en ondes carrées lors de la stimulation dynamique. Reliez la valve magnétique à deux positions à trois voies et la puce microfluidique à l’aide de tubes en silicone.

Ensuite, lance le système de pompe programmable pour amorcer le tube. Ensuite, en utilisant les connecteurs en acier inoxydable inclinés à 90 degrés de 1,3 millimètre de diamètre, fixez les ports d’entrée et de sortie de la puce microfluidique au tuyau. Connectez la sortie de la puce microfluidique au réservoir de déchets, puis redémarrez la pompe pour délivrer une contrainte de cisaillement oscillatoire combinée glucose et pulsatile pendant un total de 30 minutes.

Après avoir effectué la vérification du champ d’écoulement, préparez la solution de travail de calceine AM et d’iodure de propidium selon les instructions du fabricant à l’extrémité expérimentale. Une fois le canal rincé une fois avec PBS, introduisez la solution de travail de calcéine AM et iodure de propidium dans le canal et incubez à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant 30 minutes dans l’obscurité. Capturez immédiatement des images fluorescentes des cellules colorées à l’aide d’un microscope à fluorescence inversée équipé d’une lentille à objectif de 10 fois.

Capturez immédiatement des images fluorescentes des cellules colorées à l’aide d’un microscope à fluorescence inversée équipé d’une lentille objective 10x. Utilisez le filtre vert à fluorescéine isothiocyanate pour la calcéine AM et le filtre rouge tétraméthylrhodamine ou rhodamine pour l’iodure de propidium. Après avoir rincé le canal trois fois avec PBS, introduisez la solution fluorescente fluorescente à contraintes oxydatives de cellules vives dans le canal et incubez comme démontré précédemment.

Rinçez le canal trois fois avec du PBS pour retirer la sonde non reliée. Capturez immédiatement des images fluorescentes en utilisant le filtre rouge lointain réglé via un objectif 20x tout en maintenant des paramètres d’exposition identiques pour tous les groupes. Ouvrez les images acquises en vert de la calceine AM et en rouge iodure de propidium dans ImageJ.

Ajustez manuellement le seuil pour chaque canal afin de distinguer les signaux fluorescents de l’arrière-plan. Utilisez le compteur cellulaire pour quantifier les cellules fluorescentes, en ajustant la taille minimale des cellules en fonction des observations afin de déterminer le nombre de cellules vivantes et mortes sur plusieurs champs de vision. Calculez le pourcentage de cellules vivantes à l’aide d’un logiciel de tableau Excel pour chaque condition expérimentale.

Ensuite, calculer la moyenne et l’écart-type à travers plusieurs champs de vision à l’aide d’un logiciel d’analyse statistique pour comparer les groupes. Glissez l’image choisie dans ImageJ. Sélectionnez Analyser et choisissez Définir l’échelle pour calibrer la taille des pixels à l’aide des métadonnées du microscope.

Ensuite, retirez le signal uniforme de fond non spécifique de toute l’image en utilisant la fonction de soustraction en sélectionnant Processus et en choisissant Soustraire Arrière-plan. Ensuite, sélectionnez Image et choisissez Ajuster suivi de Seuil pour ajuster manuellement le curseur de seuil et définir le signal d’espèce réactive intracellulaire de l’oxygène. Définissez les mesures en sélectionnant Analyser et en choisissant Mesures d’ensemble pour inclure la Surface et la valeur grise moyenne.

Sélectionnez Analyser et Analyser les particules pour déterminer la taille minimale de la cellule en fonction des dimensions observées et mesurer l’intensité moyenne du signal segmenté dans le ROI de la monocouche cellulaire. Indiquez le niveau d’espèces réactives d’oxygène pour chaque condition expérimentale comme la moyenne des valeurs mesurées dérivées d’au moins trois champs de vue sélectionnés au hasard par puce. Saisissez les résultats quantitatifs dans un logiciel d’analyse de données et de graphisme.

Déterminer la signification statistique en comparant les groupes expérimentaux avec le groupe témoin à l’aide d’une analyse bidirectionnelle de la variance suivie d’un test post-hoc de Tukey avec un niveau de signification de 0,05. Utilisez le logiciel pour effectuer l’analyse et générez des graphiques avec des barres d’erreur représentant l’écart-type. Des images de fluorescence représentatives ont montré une forte proportion de cellules viables dans tous les groupes, avec une mort cellulaire négligeable observée dans le glucose normal et le glucose normal avec des groupes de contrainte de cisaillement pulsatile, tandis que le glucose oscillatoire et le glucose oscillatoire avec groupes de contrainte de cisaillement pulsatile ont montré une augmentation visible des cellules mortes.

L’analyse quantitative a montré que l’exposition au glucose oscillatoire a entraîné une réduction significative de la viabilité cellulaire par rapport au groupe témoin, et que l’application de contraintes de cisaillement pulsatile dans des conditions de glucose oscillatoire augmentait significativement la viabilité par rapport au glucose oscillatoire seul. Dans des conditions normales de glucose, les niveaux d’espèces réactives intracellulaires de l’oxygène étaient faibles et encore réduits après l’application de contraintes de cisaillement. Alors que les conditions oscillatoires de glucose ont provoqué une augmentation marquée de l’intensité de fluorescence rouge, indiquant une élévation des espèces réactives de l’oxygène.

L’augmentation oscillatoire induite par le glucose des espèces réactives intracellulaires d’oxygène a été réduite après l’application de contraintes de cisaillement. L’analyse quantitative a révélé que la contrainte de cisaillement réduisait significativement les niveaux d’espèces réactives de l’oxygène dans des conditions normales de glucose. En revanche, les conditions oscillatoires de glucose ont conduit à une augmentation significative des niveaux d’espèces réactives d’oxygène par rapport au glucose normal.

De plus, la contrainte de cisaillement a significativement réduit les niveaux d’espèces réactives d’oxygène, même dans des conditions oscillatoires de glucose. Ce protocole permet de quantifier les niveaux de ROS et la disponibilité cellulaire pour étudier le dysfonctionnement endothélial sous hyperglycémie oscillatoire et la contrainte de cisaillement pulsatile. Suite à cette procédure, des analyses moléculaires, telles que la voie NRF2 ou la signalisation iNOS, peuvent être réalisées pour énucléer les mécanismes de protection endothéliale.

De futures études pourraient utiliser ce système pour explorer les voies mécanobiologiques, intégrer la perturbation des géométries de flux ou la co-culture des cellules musculaires lisses.