Caractérisation des sondes de Riboglow in vitro comme base de l’imagerie à vie par fluorescence dans les cellules vivantes de mammifères et les modèles cellulaires tridimensionnels

Nos recherches se concentrent sur la visualisation de l'ARN dans des cellules vivantes pour étudier la dynamique spatio-temporelle de l'ARN. La plateforme Riboglow utilise l'imagerie quantitative par temps de vie de fluorescence en microscopie dans des systèmes multicellulaires applicables aux systèmes biologiques en santé et en maladie. Pour commencer, obtenez les échantillons d'ARN ou les cellules avec des sondes Riboglow chargées de billes.

Allumez le système de microscope confocal à balayage laser suivi de l'unité de contrôle du microscope. Allumez le système d'imagerie par temps de vie de fluorescence basé sur le comptage de photons simple corrélé dans le temps ou FLIM, y compris l'unité de combinaison de laser, le détecteur photomultiplicateur et le minuteur d'événements. Après avoir ouvert le logiciel d'acquisition et d'analyse d'images NIS, sous la fenêtre de configuration et de configuration, sélectionnez AX avec PicoQuant.

Une fois que le logiciel a démarré, sélectionnez AX FLIM et FCS. Pour configurer le microscope pour l'acquisition de données de temps de vie de fluorescence, confirmez que Galvano est sélectionné dans la section AX pad. Réglez la valeur d'agrégation sur une et le temps d'attente sur deux.

Dans la section puissance laser, abaissez les curseurs laser individuels à 3 à 4% Réglez le curseur laser tout sur un. Après avoir sélectionné l'objectif 20X, dans les paramètres de zone de balayage, sélectionnez 512 par 512 et activez les détecteurs. Pour définir le chemin du fichier de données, allez au bas de la section du contrôleur et sélectionnez configurer.

Après avoir cliqué sur l'onglet PicoQuant ou FLIM FCS, sous le chemin d'espace de travail, sélectionnez le symbole de dossier sur la droite. À l'emplacement de stockage, créez un nouveau dossier pour les expériences du jour et fermez la fenêtre de configuration. Une fois que live est sélectionné et que la fenêtre d'acquisition d'images apparaît, sélectionnez live à nouveau pour mettre en pause la collecte de photons.

Pour configurer les fenêtres de collecte de données d'imagerie par temps de vie de fluorescence ou FLIM, cliquez avec le bouton droit sur la fenêtre d'image en direct et sélectionnez le plugin PicoQuant. Activez afficher la courbe de décroissance, afficher la trace temporelle et afficher les statistiques FLIM. Pour configurer la disposition du laser pour l'expérience cellulaire, allez aux paramètres de l'expérience en haut à droite de la page à côté des lasers.

Après avoir cliqué sur l'ajout à côté de la boîte de colorant multicanal, ajoutez les colorants souhaités. Sélectionnez le mode expert. Ajustez les affectations des détecteurs pour chaque spectre d'émission.

Dirigez les spectres d'excitation et d'émission qui se chevauchent vers différents détecteurs. Sur le panneau de gauche, ajustez l'ordre de passage pour minimiser la diaphonie entre les colorants ayant des spectres d'excitation et d'émission qui se chevauchent. Après avoir enregistré et nommé la nouvelle configuration du laser, sélectionnez la configuration enregistrée pour l'expérience.

Cliquez avec le bouton droit sur la fenêtre d'acquisition en direct. Choisissez les contrôles d'acquisition, puis sélectionnez XYZ aperçu. Avant de charger la plaque de culture cellulaire d'imagerie pour FLIM, ajoutez la teinture nucléaire cellulaire vivante et mélangez-la soigneusement en faisant pivoter doucement sur le banc et mettez de côté pendant 30 secondes.

Placez la plaque d'imagerie sur la scène du microscope. Poussez la plaque vers le coin inférieur gauche de la scène du microscope. Collez l'échantillon sur la scène lorsque vous utilisez des objectifs non aériens pour empêcher le décalage XY.

Passez au canal 4'6-Diamidino-2-phénylindole ou DAPI. Utilisez le bouton de commande jusqu'à ce que les noyaux cellulaires soient au point. Si nécessaire, ajustez la sensibilité du bouton de hauteur Z, et si les cellules n'apparaissent pas en vue, ajustez les coordonnées XY.

Pour activer le système de mise au point parfaite ou l'autofocus PFS, sur le côté droit du panneau AX, sélectionnez la loupe à côté du bouton PFS. Une fois que le microscope a normalisé automatiquement la hauteur Z, confirmez que le bouton PFS s'allume et s'affiche au point. À l'aide du détecteur AX, trouvez les cellules souhaitées en utilisant le canal DAPI.

Puis passez au canal ATO 590 pour identifier efficacement les cellules chargées de billes. Une fois qu'une cellule est identifiée et centrée par un double clic, passez à AX FLIM et FCS. En s'assurant que 512 par 512 est sélectionné, ajustez la taille du cadre en cliquant et en faisant glisser les coins pour l'adapter à la cellule.

Laissez le cadre redimensionné devenir rouge. Cliquez avec le bouton droit à l'intérieur du cadre ou sélectionnez live jusqu'à ce que le cadre devienne vert pour confirmer l'ajustement. Après avoir ajusté le nombre de captures à la valeur souhaitée, sélectionnez capturer.

Observez la nouvelle fenêtre de capture et la boîte de progression de capture sur le côté droit de l'écran. Une fois que le logiciel d'analyse FLIM est ouvert, naviguez vers le bon chemin de fichier. Observez les acquisitions qui peuplent automatiquement la fenêtre du logiciel d'analyse.

Renommez les acquisitions à mesure qu'elles sont collectées. Lorsque la capture est terminée, revenez au détecteur AX. Sélectionnez live pour rechercher une nouvelle cellule.

Ajustez la taille de la fenêtre AX FLIM et de la spectroscopie de corrélation de fluorescence ou FCS au besoin pour les cellules plus grandes ou plus petites. Après avoir acquis de nouvelles cellules pendant la période d'imagerie de trois heures, exportez le fichier sptw créé. Procédez au traitement et à l'analyse des données FLIM pour extraire les mesures de temps de vie de fluorescence des échantillons collectés.

Les courbes de décroissance représentatives ont montré que la présence de l'étiquette ARN A augmentait le temps de vie de fluorescence extrait in vitro, tandis que les échantillons sans étiquette ARN A montraient des courbes de décroissance décalées vers la gauche, indiquant des valeurs moyennes de temps de vie plus courtes. Les temps de vie de fluorescence cellulaires des cellules chargées de billes avec 3xGly étaient significativement plus faibles que ceux chargés de 5xGly. Les courbes de décroissance représentatives ont montré que les cellules chargées de 3xGly avaient des courbes de décroissance décalées vers la gauche par rapport aux cellules chargées de 5xGly, indiquant des valeurs moyennes plus faibles de temps de vie de fluorescence.

Le noyau des cellules chargées de sonde Riboglow montrait systématiquement des temps de vie de fluorescence plus élevés que le cytosol de la même cellule. La fenêtre d'acquisition de l'échelle de couleurs fausses, les courbes de décroissance et les valeurs moyennes extraites de tau ont toutes montré la même tendance de temps de vie de fluorescence. Ce protocole permet aux chercheurs de déterminer le temps de vie de fluorescence des molécules fluorescentes dans différents contextes biologiques.

Les chercheurs peuvent effectuer une analyse de données quantitative et évaluer les variables d'intérêt suivant cette procédure, y compris l'ajout de ligands d'ARN. Les études futures peuvent appliquer Riboglow FLIM aux modèles de maladie, élargir les capacités de multiplexage et suivre la dynamique de l'ARN dans les systèmes d'animaux vivants.