Test de protection de l’amikacine pour la quantification et la visualisation de l’invasion des cellules d’Escherichia coli

Nous nous concentrons sur la caractérisation de la manière dont les E. coli envahissants adhérents envahissent les cellules épithéliales intestinales et sur l’identification des facteurs bactériens contribuant à ce processus. Les isolats résistants à la gentamycine limitent les tests d’invasion traditionnels. Ce protocole basé sur l’amikacine permet une quantification précise des bactéries intracellulaires.

Pour commencer, rassemblez tous les réactifs et médias nécessaires à l’analyse de l’invasion. Ensuite, récupérez le stock congelé de glycérol de souche invasive d’Escharicia colli, ou AIEC, dans le congélateur à 80 degrés Celsius. À l’aide d’un bâton ou d’une pointe de pipette en bois stérile, grattez doucement les bactéries de la tige et laissez-les passer sur une tarière Luria-Bertani, ou LB, pour obtenir des colonies uniques.

Incubez l’assiette à 37 degrés Celsius toute la nuit. Le lendemain, à l’aide d’un bâton ou d’une pointe de pipette en bois stérile, retirez une colonie unique de la plaque sans fin sans fin. Inoculez la colonie dans 3 millilitres de bouillon LB et incubez la culture à 37 degrés Celsius à 200 tours par minute pendant la nuit.

Ensuite, effectuez une dilution de 1 à 10 de la culture nocturne dans 1 millilitre de bouillon LB. Mesurez la densité optique à 600 nanomètres de la culture diluée à l’aide d’un spectrophotomètre. Transférez 100 microlitres de la culture nocturne dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre et centrifugez à 6 000 G pendant 10 minutes à 4 degrés Celsius.

Aspirez soigneusement le surnageant sans déranger la granule cellulaire et resuspendez la pellete dans 1 millilitre de milieu sérique et sans antibiotiques. Calculez le volume requis de suspension bactérienne pour obtenir une multiplicité d’infections ou MOI de 10 en utilisant la formule fournie. Pour préparer le milieu infectieux, transférez le volume calculé de la suspension bactérienne dans un tube stérile de microcentrifuge de 1,5 millilitre et complétez le volume à 1 millilitre avec un milieu sérique et sans antibiotiques.

Mélangez doucement en pipettant plusieurs fois. Préparez une plaque de 96 puits pour déterminer les unités formant la colonie par millilitre de la culture bactérienne diluée pendant la nuit en effectuant des dilutions en série dix fois plus dans un PBS stérile 1X. Transférez 200 microlitres de la culture diluée pendant la nuit dans le premier puits de la plaque.

Pipeter 20 microlitres de la culture dans la rangée suivante contenant 180 microlitres de PBS 1X. Mélangez en pipettant 10 fois et répétez le processus de dilution jusqu’à atteindre 10 à la puissance de 6 à chaque fois avec une pointe de pipette fraîche. Maintenant, plaquez 10 microlitres de dilutions ponctuelles en triple exemplaires de 10 à la puissance de 2 à 10 puis à la puissance de 6 dilutions sur des plaques sans fin LB.

Laissez les taches s’absorber dans la vis à tarière près d’une flamme. Incubez les plaques toute la nuit à 27 à 30 degrés Celsius pour éviter la surcroissance des colonies et obtenir des colonies individuelles claires. Retirez les monocouches épithéliales confluentes saines de Caco-2 cultivées dans une plaque de culture à 24 puits recouverte de collagène de l’incubateur et aspirez le milieu complet de chaque puits.

Pipeter un millilitre de milieu sérique et sans antibiotiques dans chaque puits. Aspirez le substrat pour enlever les traces de substrat et répétez le lavage une fois de plus pour un total de deux lavages. Ajoutez maintenant 1 millilitre du milieu d’infection préalablement préparé contenant l’AIEC dans chaque puits de la plaque à 24 puits contenant les cellules Caco-2.

Centrifugez la plaque à 24 puits à 500 G pendant 15 minutes à température ambiante pour synchroniser le contact bactérien avec la monocouche épithéliale et incubez la plaque à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant trois heures afin de permettre l’invasion bactérienne. Préparez un milieu contenant des antibiotiques en ajoutant 240 microgrammes par millilitre d’amikacine à des milieux sérumiques préchauffés et sans antibiotiques. Après la période d’infection, aspirez les milieux des monocouches cellulaires Caco-2 et lavez chaque puits avec 1 millilitre de sérum et de milieux sans antibiotiques.

Aspirez le substrat et répétez le lavage une fois de plus pour un total de deux lavages. Ensuite, pipeter un millilitre de 240 microgrammes par millilitre de milieux contenant de l’amikacine dans chaque puits. Parallèlement, traiter un autre groupe de cellules avec 100 microgrammes par millilitre de gentamicine pour comparaison et incuber les cellules à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant 1 heure afin d’éliminer les bactéries extracellulaires.

Après l’incubation, aspirez le milieu de chaque puits. Ajoutez 1 millilitre de PBS pour éliminer les bactéries adhérentes. Aspirez le PBS et répétez le lavage une fois de plus pour un total de deux lavages.

Ajoutez maintenant 200 microlitres de 1 % Triton X100 dilué dans PBS dans chaque puits et incubez sur un shaker orbital à 90 tours par minute pendant 10 minutes pour lyser les cellules épithéliales. Pipette vers le haut et vers le bas environ 30 fois par puits pour détacher les cellules de la plaque. Ensuite, effectuez des dilutions en série dix fois plus grandes des lysats cellulaires dans une plaque de 96 puits à l’aide de PBS.

Plaque 10 microlitres de dilutions ponctuelles en triple fraction des non diluées à 10 à la puissance de 3 dilutions sur des plaques sans fin LB. Après que les zones soient sèches, incubez les plaques toute la nuit à 27 à 30 degrés Celsius pour obtenir des colonies individuelles claires. Après l’incubation, retirez les plaques et comptez les colonies bien isolées provenant des dilutions ponctuelles appropriées contenant plus de sept colonies par tache à travers les triplicats.

Enfin, calculez l’inocule et les unités formatrices de colonies récupérées par millilitre et le pourcentage d’invasion à l’aide des équations. Le traitement avec de la gentamicine ou de l’amikacin après infection des monocouches de cellules Caco-2 avec la souche invasive AIEC NRG857c, ou la souche non invasive Escherichia coli DH5 alpha contrôle, a conduit à des profils d’invasion similaires. Ces résultats indiquaient que l’amikacin était aussi efficace que la gentamicine pour éliminer les bactéries extracellulaires et reflétait fidèlement la charge bactérienne intracellulaire.

Le traitement des isolats cliniques d’Escherichia coli résistants à la gentamicine obtenu auprès de patients atteints de maladie inflammatoire intestinale avec la gentamicine a donné des valeurs de récupération bactériennes très variables, allant d’environ 21 à 2 788 %. En revanche, le traitement à l’amikacine a considérablement réduit la récupération bactérienne sur tous les isolats, démontrant son efficacité et permettant des mesures d’invasion plus fiables. Ce protocole permet une quantification précise des bactéries intracellulaires et une évaluation de l’invasion bactérienne dans les cellules épithéliales. D’autres méthodes telles que la microscopie à immunofluorescence peuvent être utilisées pour valider davantage l’invasion bactérienne et valider la localisation intracellulaire.

De futures études pourront identifier de nouveaux facteurs de virulence et étudier les voies de l’hôte ciblées lors d’une infection invasive par adhérence à E. coli.