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	<li>Almansour, N. M. Triple-negative breast cancer: brief review about epidemiology, risk factors, signaling pathways, treatment and role of artificial intelligence. Front Mol Biosci. 9, 836417 (2022).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>100 mm plate</td><td>Corning</td><td>353003</td><td>Culture cellulaire</td></tr><tr><td>45 &micro;m filter&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLHVM33RS</td><td>Culture cellulaire</td></tr><tr><td>6 well plate</td><td>Corning</td><td>3506</td><td>Culture cellulaire</td></tr><tr><td>96-well black clear bottom plates</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS356259</td><td>Pour l'essai de viabilité cellulaire luminescente CellTiter-Glo</td></tr><tr><td>Blasticidin</td><td>Thermo Fisher</td><td>A1113903</td><td>Pour la sélection</td></tr><tr><td>CellTiter-Glo luminescent cell viability assay</td><td>CellTiter-Glo, Promega</td><td>G7570</td><td>Pour l'essai de viabilité cellulaire luminescente CellTiter-Glo</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td></td><td>Culture cellulaire</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A3672,0050</td><td>Culture cellulaire</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>16140071</td><td>Culture cellulaire</td></tr><tr><td>Ham&rsquo;s F12 nutrient mix</td><td>Gibco</td><td>11765054</td><td>Culture cellulaire</td></tr><tr><td>HEK293T cells</td><td></td><td></td><td>Don gracieux de Robert Weinberg (MIT, Boston, États-Unis).</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher</td><td>15630080</td><td>Culture cellulaire</td></tr><tr><td>Hydrocortisone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4001-1G</td><td>Culture cellulaire</td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9278-5ML</td><td>Culture cellulaire</td></tr><tr><td>LentiCas9-blast</td><td>Addgene&nbsp;</td><td>#52962</td><td>Pour la génération de lignées cellulaires Cas9 stables</td></tr><tr><td>LentiGuide-Puro&nbsp;</td><td>Addgene&nbsp;</td><td>#52963</td><td>Support pour le clonage gRNA&nbsp;</td></tr><tr><td>MN NucleoSpin tissue kit</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740952.5</td><td>Pour l'extraction d'ADN génomique</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>10010023</td><td>Culture cellulaire</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>Culture cellulaire</td></tr><tr><td>pLentiCRISPR v2&nbsp;</td><td>Addgene&nbsp;</td><td>#52961</td><td>Support pour le clonage gRNA&nbsp;</td></tr><tr><td>Polyethylene glycol (PEG)-8000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2139-500G</td><td>Pour la concentration de lentivirus</td></tr><tr><td>Polyethylenimine, linear (PEI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>765090-1G</td><td>Pour la production de lentivirus</td></tr><tr><td>Protamine sulfate (PS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4380-25G</td><td>Pour l'infection par lentivirus</td></tr><tr><td>psPAX2</td><td>Addgene&nbsp;</td><td># 12260</td><td>Pour la production de lentivirus</td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Thermo Fisher</td><td>A1113803</td><td>Pour la sélection</td></tr><tr><td>SUM159PT adherent cells</td><td></td><td></td><td>Don gracieux de Robert Weinberg (MIT, Boston, États-Unis).</td></tr><tr><td>Taxol</td><td>Paclitaxel, Sigma</td><td>PHR1803-200MG</td><td>Pour la génération et le maintien des cellules res</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.05%)</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>25300054</td><td>Culture cellulaire</td></tr><tr><td>Verapamil</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S4202</td><td>Pour la sélection</td></tr><tr><td>VSV-G</td><td>Addgene&nbsp;</td><td># 8454</td><td>Pour la production de lentivirus</td></tr></tbody></table>

criblages knockout à l’échelle de l’épigénome basés sur crispr-cas9 sur des cellules chimiorésistantes

Epigenome-Wide CRISPR-Cas9-Based Knockout Screens on Chemoresistant Cells

Criblages knockout à l’échelle de l’épigénome basés sur CRISPR-Cas9 sur des cellules chimiorésistantes

Chemotherapy resistance remains a major challenge in cancer treatment, driven by cancer cells&#39; ability to acquire adaptive properties, rewire ...

Nous étudions les mécanismes épigénétiques responsables de la résistance chimiothérapeutique dans le cancer du sein triple négatif en utilisant des approches de criblage basées sur CRISPR. Pour commencer, ajustez environ 159 cellules adhérentes PT à 2 fois 10 à la puissance 3 cellules par puits dans des plaques de 96 puits à fond noir-transparent avec le milieu nutritif Ham's F-12, complété par les composants indiqués. Incubez les cellules pendant 16 heures dans une étuve à culture cellulaire à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.Ensuite, préparez un stock de Taxol dissous dans du diméthylsulfoxyde ou DMSO. Pour traiter les cellules, préparez des dilutions sériées de Taxol dans le milieu de culture, allant de 0,3 nanomolaire à 10 micromolaire, et utilisez du DMSO seul comme témoin véhicule. Traitez les cellules avec 200 microlitres de doses croissantes de Taxol en triple exemplaire.Laisser la plaque dans un incubateur de culture cellulaire pendant 72 heures à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone. Après 72 heures de traitement par le médicament, évaluer la viabilité cellulaire à l’aide d’un dosage de quantification de l’ATP basé sur la luminescence. Mesurer la luminescence à l’aide d’un lecteur de microplaques et normaliser les résultats par rapport aux valeurs du témoin DMSO.Ensuite, calculez les valeurs de concentration inhibitrice à 10 % et à 50 % à l’aide d’une régression non linéaire avec un modèle de réponse dose-effet logistique à quatre paramètres dans un logiciel statistique approprié. Pour commencer la génération de cellules chimiorésistantes, ensemencez 2 fois 10 à la puissance de 5 cellules A549 PT par puits dans des plaques de six puits. Incubez toute la nuit à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone.Le lendemain, traitez les cellules avec des concentrations inhibitrices de 10 % ou 50 % de Taxol dans deux millilitres de milieu de culture pendant 72 heures. Si les cellules tolèrent la concentration actuelle du médicament, divisez-les en deux puits. Conservez l'un comme témoin de secours avec du milieu frais et doublez la concentration de Taxol dans l'autre puits.Lors de la génération de cellules résistantes, passez les cellules parentales dans un milieu contenant du DMSO comme témoin et ajustez le volume de DMSO afin qu'il corresponde à la quantité présente dans le traitement au Taxol correspondant. Mesurez la viabilité cellulaire toutes les trois à quatre semaines jusqu'à ce qu'une différence significative des valeurs de concentration inhibitrice 50 % soit observée entre les lignées cellulaires parentales et résistantes. Maintenez les cellules résistantes stables à la concentration finale de Taxol utilisée lors de l'escalade de dose.Pour la caractérisation des cellules résistantes, réalisez un séquençage de l'ARN, un immunoblot, une qPCR et des tests de viabilité cellulaire en présence du médicament. Semez environ 159 cellules parentales et résistantes au Taxol par plaques, en triple exemplaire, dans des plaques noires à fond transparent de 96 puits, à raison de 2 × 10³ cellules par puits. Incubez les cellules toute la nuit à 37 °C avec 5 % de dioxyde de carbone.Traitez les cellules avec des dilutions sérielles deux fois plus faibles de vérapamil, allant de 80 micromolaire à 1,25 micromolaire, tout en maintenant une concentration constante de Taxol dans toutes les conditions de traitement. Après 72 heures de traitement, évaluez la viabilité cellulaire à l’aide d’un dosage de quantification de l’ATP basé sur la luminescence. Déterminez la concentration de vérapamil qui préserve la viabilité cellulaire tout en restaurant la sensibilité dans les cellules résistantes.Pour déterminer la concentration de puromycine à utiliser en association avec le vérapamil, ensemencez environ 159 cellules PT résistantes au Taxol dans une plaque de 96 puits à raison de 2 × 10³ cellules par puits. Incubez la plaque pendant 16 heures à 37 °C et 5 % de dioxyde de carbone. Préparez des dilutions sérielles doubles de puromycine, allant de 40 à 0,625 microgramme par millilitre, dans un milieu contenant la concentration de vérapamil précédemment déterminée.Traitez les cellules avec les dilutions de puromycine pendant 72 heures. Après le test de viabilité, identifiez la concentration minimale de puromycine qui réduit la viabilité à 5 % ou moins en présence de vérapamil. Utilisez ensuite environ 159 cellules PT résistantes au taxol pour calculer la titration virale et la multiplicité d'infection.Ajouter le volume calculé de lentivirus Cas9, en fonction de la multiplicité d'infection souhaitée, directement aux cellules dans le milieu de culture contenant huit microgrammes par millilitre de sulfate de protamine. Remplacer le milieu viral par du milieu frais 16 heures après l'infection. Le jour suivant, appliquer une sélection à la blasticidine en remplaçant le milieu de culture par un milieu contenant la concentration de blasticidine déterminée précédemment.Poursuivez la sélection jusqu'à l'élimination des cellules non infectées. Validez l'activité de Cas9 à l'aide de RNAs guides simples contrôle pour des gènes essentiels ou utilisez GFP comme rapporteur pour évaluer l'efficacité de l'extinction génique. Calculez le nombre de cellules infectées avec succès nécessaires pour atteindre la couverture souhaitée de la bibliothèque en utilisant l'équation présentée.Préparez des mélanges d'infection indépendants pour chaque réplicat biologique. Après avoir semé les cellules calculées précédemment, infectez-les avec un volume viral déterminé dans huit millilitres de milieu de culture complet contenant huit microgrammes par millilitre de sulfate de protamine. Après 16 heures, remplacez le milieu viral par du milieu frais et incubez les cellules à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone.Appliquer une sélection à la puromycine en présence de vérapamil aux concentrations déterminées précédemment afin d'enrichir les cellules infectées par le sgARN parmi environ 159 cellules PT résistantes au taxol. Poursuivre la sélection jusqu'à ce que toutes les cellules de la plaque témoin non infectée soient éliminées. Généralement, pendant environ trois jours.Après la sélection par la puromycine et le vérapamil, trypsinez les cellules et récupérez un point temporel initial, le culot cellulaire au temps zéro, à partir de chaque réplicat biologique correspondant au niveau de couverture déterminé lors de la transduction. Répartissez les cellules en bras expérimentaux tout en préservant la couverture. Un bras sert de témoin avec DMSO.Et l'autre comme traitement avec le Taxol. Maintenir les cultures pendant 14 à 16 doubles populations. Calculer le niveau de doublement de population à l'aide de la formule spécifiée.À chaque passage, surveillez la viabilité cellulaire et la cinétique de croissance. Maintenez un nombre adéquat de cellules afin d'éviter les goulots d'étranglement. Une fois le niveau de doublement de population souhaité atteint, collectez les culots du point temporel final pour chaque réplicat et chaque condition, tout en préservant la couverture de la bibliothèque par culot.Conserver les culots à 80 degrés Celsius jusqu'à l'extraction ultérieure de l'ADN génomique. Les cellules résistantes ont continué à proliférer, malgré le traitement par le Taxol, tandis que les cellules parentales n'ont pas survécu sous le même traitement. Le séquençage de l'ARN a identifié ABCB1 comme l'un des gènes les plus surexprimés dans les cellules résistantes, suivi par d'autres transporteurs ABC, notamment ABCB4 et ABCA5.L'up-régulation de l'expression de ABCB1 dans les cellules résistantes a été validée par PCR quantitative. Les cellules résistantes au Taxol présentaient un phénotype de résistance multithérapeutique ainsi qu'une résistance à la doxorubicine et à la vincristine. La sélection par la puromycine pourrait ne pas être efficace dans les cellules résistantes, car la puromycine peut être expulsée par un efflux médiqué par ABCB1.Le vérapamil seul n'a pas affecté la viabilité cellulaire. Toutefois, lorsqu'il est combiné à des agents chimiothérapeutiques, le vérapamil restaure la sensibilité à ces agents. Des doses non toxiques de vérapamil restaurent également la sensibilité à la puromycine dans les cellules résistantes au Taxol.Lorsque les échantillons du point temporel final provenant des conditions traitées au DMSO ou au Taxol ont été comparés au point temporel initial, presque tous les gènes essentiels étaient appauvris après inactivation, confirmant la qualité du criblage. En revanche, la comparaison des échantillons terminaux traités au DMSO et de ceux traités au Taxol n'a pas montré d'appauvrissement des gènes essentiels, car ces gènes restent essentiels dans les deux groupes. Cette comparaison met plutôt en évidence des modificateurs épigénétiques sensibilisateurs au Taxol.Plusieurs gènes de contrôle positif et modificateurs épigénétiques ont été significativement appauvris dans l'écran EPIKOL réalisé sur des cellules résistantes au Taxol. Les ARN guides uniques ciblant ABCB1 ont été spécifiquement appauvris dans le groupe traité au Taxol, confirmant ainsi ABCB1 comme contrôle positif de la sensibilité au Taxol dans cet écran. Ce protocole permet aux chercheurs d'étudier la résistance thérapeutique dans des modèles de cancer et d'identifier des régulateurs épigénétiques de la résistance aux chimiothérapies à l'aide de plates-formes de criblage CRISPR.La considération la plus importante lors du criblage de cellules chimiorésistantes est de maintenir la représentation de la bibliothèque et d'optimiser les conditions de transduction et de sélection. Les travaux futurs permettront d'identifier les vulnérabilités thérapeutiques des cellules cancéreuses résistantes à plusieurs médicaments et de développer de nouvelles approches combinatoires pour surmonter la chimiorésistance.

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Recherche sur le cancer

La technique de génotypage décrit ici, qui couple de réaction en chaîne par polymérase fluorescente (PCR) à une électrophorèse sur gel capillaire, permet de génotypage à haut débit des clones knock-out à médiation par nuclease. Il évite les limitations rencontrées par d'autres techniques de génotypage et est plus rentable que les méthodes de séquençage.

L&#39;utilisation d&#39;un PCR-capillaire fluorescent Gel Electrophoresis Technique pour Génotype CRISPR / cas9 médiation Knockout Mutants dans un format à haut débit

Les progrès récents dans la capacité de manipuler génétiquement les lignées cellulaires somatiques offrent un grand potentiel pour la recherche fondamentale et appliquée. Ici, nous présentons deux approches pour la production et le dépistage de knock-out créés par CRISPR / Cas9 dans des lignées cellulaires de mammifères, avec et sans utilisation de marqueurs sélectionnables.

Génération indépendante et dépendante de la sélection de CRISPR / Cas9-Meded Knockouts dans les cellules de mammifères

Nous présentons ici un protocole pour optimiser CRISPR-Cas9 pour parvenir à une plus grande spécificité sans la perte d’activité sur la cible. Nous utilisons une approche d’évolution dirigée appelée Sniper-écran pour trouver un mutant Cas9 avec les caractéristiques souhaitées. Sniper-Cas9 est compatible avec tronqué ARN simple-guide et livraison dans un format ribonucléoprotéines, célèbres stratégies pour atteindre les spécificités plus élevées.

À l’aide de Sniper-Cas9 pour minimiser les effets hors cible de CRISPR-Cas9 sans la perte d’activité sur la cible Via évolution dirigée

La technologie CRISPR-Cas9 fournit une méthode efficace pour modifier précisément le génome des mammifères dans n'importe quel type de cellule et représente un nouveau moyen d'effectuer des écrans génétiques à l'échelle du génome. Un protocole détaillé discutant des étapes requises pour la réussite des écrans CRISPR-Cas9 à l'échelle du génome sont fournis ici.

Écrans génétiques crispR-basés en commun dans les cellules de mammifères

Ce manuscrit décrit une approche de dépistage à l’échelle du génome basée sur les cellules pour identifier les interactions extracellulaires de récepteur-ligand.

Identification des récepteurs de surface cellulaire à l’aide d’écrans génétiques CRISPR/Cas9 à l’échelle du génome

Le dépistage par interférence ARN (ARNi) à haut débit à l’aide d’un pool d’ARNs lentiviraux peut être un outil pour détecter des cibles létales synthétiques pertinentes sur le plan thérapeutique dans les tumeurs malignes. Nous fournissons une approche de dépistage de l’ARNs pour étudier les effecteurs épigénétiques de la leucémie myéloïde aiguë (LAM).

Dépistage en pool de la bibliothèque d’ARNH pour identifier les facteurs qui modulent un phénotype de résistance aux médicaments

L’article décrit un protocole pour l’application d’un modèle in vitro d’épuisement afin de réaliser un dépistage CRISPR knock-out à l’échelle du génome dans des cellules T à récepteur antigénique chimérique de donneur sain.

Réalisation d’un criblage CRISPR in vitro à l’échelle du génome dans des cellules T à récepteur d’antigène chimérique

Ici, nous présentons un protocole qui intègre la technologie CRISPR/Cas9 avec le test Cell Counting Kit-8 (CCK-8) pour identifier les gènes candidats qui sont cruciaux pour la capacité de prolifération anormale des cellules souches hématopoïétiques et progénitrices.

Évaluation de gènes anormaux liés à la croissance de cellules souches et progénitrices hématopoïétiques en combinant la technologie CRISPR/Cas9 avec le comptage cellulaire

Cette étude présente un double système CRISPRi ciblant les ARN longs non codants dans les cellules de mélanome. Il permet l’inactivation combinatoire de gènes et le criblage létal synthétique, en identifiant les interactions d’ARNlnc spécifiques au cancer pour des stratégies thérapeutiques potentielles.

Stratégie d’interférence CRISPR double pour cibler les interactions létales synthétiques entre des ARN non codants dans des cellules cancéreuses

Une approche méticuleuse et structurée est donnée pour sélectionner les gènes résistants et sensibles des rayonnements grâce à l’application d’une méthode de criblage CRISPR/Cas9 à l’échelle du génome. Ce protocole a également le potentiel de servir de cadre polyvalent pour d’autres efforts de recherche portant sur les mécanismes de résistance aux médicaments chimiques administrés cliniquement.

Écran CRISPR à l’échelle du génome pour dévoiler les gènes radiosensibles et radiorésistants

Nous avons développé un protocole optimisé de dépistage CRISPR-Cas9 pour les cellules CAR T primaires. En réduisant la transmission d’ADNgDNA par la digestion enzymatique et le pulldown des cassettes d’ARNsg, cette approche minimise les artefacts PCR, assurant une détection précise des sgRNA et une identification robuste des cibles géniques fonctionnelles.

Améliorer les écrans CRISPR-Cas9 dans les cellules CAR T : une méthode affinée pour la préparation des bibliothèques

Koç University School of Medicine.  Ici, nous présentons un protocole pour générer des cellules chimiorésistantes en utilisant une approche d’escalade de dose, suivi d’un criblage basé sur CRISPR/Cas9 utilisant une bibliothèque focalisée d’ARNsgRNA ciblant les modificateurs épigénétiques pour identifier les régulateurs de la chimiorésistance acquise. Le protocole fournit également plusieurs points d’optimisation adaptés aux modèles cellulaires chimior...

Criblages knockout à l’échelle de l’épigénome basés sur CRISPR-Cas9 sur des cellules chimiorésistantes

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