Immunolocalisation tridimensionnelle chez les méiocytes de maïs

Notre recherche se concentre sur le développement d'une approche 3D pour étudier les méiocystes mâles du maïs et visualiser les protéines méiotiques dans des cellules individuelles. Outre le maïs, ce protocole peut être appliqué à l'étude des méiocystes du riz, du seigle, de l'orge et du blé. Pour commencer, obtenir des plantes de maïs au stade V13, avec les inflorescences encore en croissance à l'intérieur de la tige.

Pendant la semaine de la fixation des anthères miotiques, appuyez doucement, tout en portant des gants, sur la tige élargie au niveau de la bosse pour vérifier si elle est suffisamment molle pour être ouverte par incision. Après avoir préparé les tampons nécessaires, préparez une chambre humide en plaçant de cinq à dix serviettes en papier humidifiées à l’intérieur d’une boîte en plastique. Éliminez l’excès d’eau de la chambre.

À l’aide d’un rasoir, couper la tige au niveau de l’inflorescence afin d’exposer les branches du panicule et les branches latérales. Après avoir disséqué et collecté les branches latérales, les envelopper dans des serviettes humides placées dans une chambre humide, en maintenant cette chambre à température ambiante. À l’aide d’un microscope stéréoscopique, prélever les anthères fraîches des fleurons dans une boîte de Pétri de 35 millimètres contenant deux millilitres de tampon A 1 X ou de tampon BA. Identifier les stades mitotiques en fonction de la taille et de la couleur.

Après avoir transféré les anthères dans une nouvelle boîte de Pétri de 35 millimètres, ajouter trois millilitres de solution fixative aux anthères. Sceller la boîte de Pétri avec du parafilm pour éviter l'évaporation du formaldéhyde. Placer la boîte de Pétri de 35 millimètres sur la boîte de Pétri plus grande positionnée sur un agitateur rotatif, réglé à 40 à 60 tr/min à température ambiante pendant 45 minutes.

Rincez les anthères avec trois millilitres de XBA 1X. Après avoir transféré les anthères dans une petite boîte de Pétri, scellez la boîte et placez-la sur un agitateur rotatif à température ambiante pendant 45 minutes, à une vitesse réglée entre 40 et 60 tr/min. À l’aide de pinces propres, transférez les anthères dans une petite boîte de Pétri de 35 millimètres contenant trois millilitres de XBA 1X.

Une fois la boîte de Pétri hermétiquement scellée avec du parafilm, placer la petite boîte de Pétri à l'intérieur d'une boîte de Pétri plus grande. Après l'avoir recouverte de papier d'aluminium, conserver l'échantillon à quatre degrés Celsius jusqu'à son utilisation. Au jour un, préparer deux millilitres de solution d'acrylamide en mélangeant des volumes égaux d'acrylamide et de deux XBA.

Dégazer la solution d'acrylamide sous vide pendant cinq à dix minutes avant d'ajouter le sulfite de sodium et le persulfate d'ammonium. Répartir 100 microlitres d'un mélange équivalent d'acrylamide et de deux XBA dans des tubes de 1,5 millilitre, selon le nombre de lames préparées. Placer des morceaux de parafilm de deux centimètres sur deux centimètres au-dessus d'une boîte de Pétri et les positionner sous un stéréomicroscope.

Après avoir coupé l'extrémité de la pipette à l'aide de ciseaux, prélevez 50 microlitres de solution de BA contenant les anthères sur du parafilm. Déposez 25 microlitres de solution de BA sur une autre zone du parafilm. Après avoir maintenu les anthères avec une pince, utilisez un scalpel pour couper leurs extrémités.

Une fois les méiocytes expulsés, utilisez une pipette pour les transférer dans la goutte de 25 microlitres de BA et mélangez délicatement. Pipetez 10 microlitres du mélange de méiocytes sur un lamelle distinct. Ajoutez rapidement cinq microlitres de sulfite de sodium et cinq microlitres de peroxydisulfate d'ammonium dans un tube de 1,5 millilitre contenant l'acrylamide et deux XBA.

Prélvez cinq microlitres de ce mélange et déposez-les sur la lame couvre-objet, puis mélangez avec les méioctyes. Placez une lame couvre-objet recouverte de poly-lysine par-dessus selon un angle de 45 degrés. Après avoir laissé polymériser complètement pendant 30 à 50 minutes à température ambiante, séparez soigneusement les lames couvre-objets à l’aide d’une lame de rasoir.

Ensuite, placez-les avec la face adhésive vers le haut dans une boîte de Pétri. Rincez la lame avec un millilitre de PBS 1X complété par un millimolaire d'acide éthylènediaminotétraacétique, ou EDTA, et 1 % de Triton, à température ambiante pendant deux heures. Préparez et associez des anticorps primaires provenant d'espèces hôtes différentes afin d'assurer des signaux distincts lors de la détection.

Ajoutez 50 microlitres de l'anticorps primaire dilué au centre du couvre-objet contenant le tampon. Ensuite, placez la boîte de Pétri dans une chambre humide pendant toute la nuit. Le deuxième jour, préparez 500 millilitres de tampon de lavage contenant un XPBS, 0,1 % de Tween 20 et un millimolaire d'EDTA.

À l’aide d’une pipette, retirez la solution de la nuit. Lavez le lamelle deux fois avec un millilitre de tampon de lavage. Après avoir retiré le tampon, ajoutez à nouveau un millilitre de tampon de lavage et incubez pendant une heure à température ambiante.

Répétez cette étape de lavage encore sept fois. Après le dernier lavage, couvrez la boîte et laissez-la toute la nuit dans une chambre humide. Préparez les anticorps secondaires en les diluant au ratio de un à 50 dans le tampon de blocage.

Après avoir retiré la solution de lavage, ajoutez 50 microlitres d'anticorps secondaire dilué au centre de chaque pastille. Ensuite, placez la boîte de Pétri dans une chambre humide pendant deux heures à température ambiante. Après avoir retiré la solution du puits, effectuez quatre lavages avec un millilitre de tampon de lavage, chacun d'une durée d'une heure à température ambiante.

Lavez le puits avec un millilitre de PBS pendant 10 minutes et répétez ce processus deux fois supplémentaires. Ajoutez 500 microlitres de DAPI, préparé à une concentration finale de un microgramme par millilitre, dans le puits et incubez pendant 30 minutes à température ambiante. Après avoir sorti le prolongateur doré de quatre degrés Celsius, laissez-le décongeler jusqu'à atteindre la température ambiante.

Lavez les lames avec un millilitre de PBS pendant 30 minutes et répétez deux fois. Après avoir éliminé la dernière solution de lavage, ajoutez deux gouttes d'agent antifade prolongé au centre du tampon. Une fois que le couvre-lame est soulevé du puits, montez-le sur les lames étiquetées.

À l’aide d’un vide, retirez l’excès de glycérol sur les bords du couvre-objet et scellez avec deux couches de vernis à ongles. Observez les lames au microscope en utilisant les longueurs d’onde d’excitation et les filtres appropriés pour capturer les images. La coloration par DAPI a révélé un noyau net ainsi qu’une coloration de la chromatine, accompagnée d’une coloration cytoplasmique plus faible, naturelle, de l’ADN des plastes et des mitochondries.

Absence d'AFD1 (Absence of first division one), d'ASY1 (asynaptic one) et de ZYP1 (Zipper1) sur les chromosomes et dans le cytoplasme au cours de la préleptotène. Aux stades ultérieurs, le signal s'est concentré sur les chromosomes, tandis qu'une quantité importante de ZYP1 est restée dans le cytoplasme avant la synapsis complète. La cohésine méiotique AFD1 a formé une structure linéaire uniquement après la zygotène.

Concomitamment à la formation de filaments linéaires du complexe synaptonémal. Le signal ASY1 est devenu relativement faible après le chargement de ZYP1 et d'AFD1 dans des structures linéaires. Ce protocole permet aux chercheurs d'étudier la co-localisation et la dynamique des protéines, la localisation subcellulaire native, l'architecture chromosomique en 3D, la progression méiotique et le staging.

Le principal défi de ce protocole consiste à sélectionner soigneusement des combinaisons compatibles d'anticorps primaires et secondaires. Des études ultérieures pourraient s'appuyer sur ce travail en comparant la méiose mâle et femelle afin d'explorer le mécanisme moléculaire sous-jacent à l'athélasie.