Name: Reconstitution de lassemblage de lactine branchée médié par la myosine-I dans un essai de motilité de queues de comètes dactine basé sur des billes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-09-03T13:05:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: Découvrez un essai de motilité de queues de comètes d'actine in vitro pour étudier l'interaction entre myosine-I, actine et complexe Arp2/3. Cette méthode permet l'analyse quantitative de l'assemblage du réseau d'actine et de la génération de force.

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Nous remercions le Dr Daniel Safer et Rick Wike pour leur excellente assistance technique dans la purification des protéines. Nous remercions le Dr Roberto Dominguez, en particulier le Dr Malgorzata Boczkowska et le Dr Grzegorz Rebowski, pour avoir généreusement fourni le complexe Arp2/3 et les protéines CapZ. Nous remercions également le Dr Luther Pollard, le Dr Faviolla A. Báez-Cruz et tous les membres des laboratoires Ostap et Dominguez pour leurs précieuses contributions tout au long du projet. Ce travail a été soutenu par une subvention des National Institutes of Health R37 GM057247 (attribuée à E.M.O.). E.M.O. et M.X. ont été partiellement soutenus par la National Science Foundation (CMMI-1548571). ChatGPT a été utilisé pour aider à la révision linguistique lors de la préparation du manuscrit. Les auteurs ont relu et modifié tout le contenu assisté par l'IA et assument l'entière responsabilité du manuscrit final.

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Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrent ou conflit d’intérêts.

Le test de motilité des billes avec queue cométaire d'actine est un système de reconstitution in vitro bien établi permettant d'étudier l'assemblage ramifié de l'actine médié par le complexe Arp2/3 et son rôle dans la génération de forces protrusives14,15,16,17. Ce système a été largement utilisé pour analyser la régulation biochimique de l'assemblage ramifié de l'actine14,15,26,27,31,49,50,51 et la production de force20,21,22,23,52, tout en fournissant un cadre pour des études quantitatives des propriétés émergentes de matière active des réseaux d'actine19,35,36,53. En incorporant la myosine, en particulier la myosine-I18, dans ce système reconstitué, le test modifié permet d'explorer comment le couplage myosine-actine module l'assemblage de l'actine et la production de force à l'interface membranaire, un domaine qui reste relativement peu exploré. Notamment, la myosine-I dans ce système peut être facilement remplacée par d'autres moteurs myosines afin d'examiner leurs rôles respectifs dans la remodélisation du réseau d'actine et la génération de force. Par exemple, la myosine V (transport de cargaison)54, la myosine VI (trafic endocytaire et dynamique membranaire)55,56, la myosine VII et XV (organisation des stéréocils et des microvillosités)57,58,59, la myosine X (formation des filopodes)60,61, et la myosine XIX (dynamique mitochondriale)62 pourraient être intégrées afin d'étudier comment différentes classes de myosines contribuent à l'organisation de l'actine et aux processus physiologiques associés.
Le test est hautement reproductible à condition que plusieurs paramètres critiques soient soigneusement contrôlés. Premièrement, une G-actine monomérique de haute qualité est essentielle à une formation robuste des queues en comète. Nous recommandons de purifier la G-actine à partir de poudre d'acétone de muscle squelettique de lapin en suivant des protocoles établis41. Après 2 à 3 jours de dialyse, l'actine monomérique doit être davantage purifiée par filtration sur gel au moyen de Sephacryl S-300 dans un tampon G (2 mM Tris-HCl, pH 8,0 ; 0,2 mM ATP ; 0,1 mM CaCl2 ; 1 mM NaN3 ; et 0,5 mM DTT). Les fractions recueillies immédiatement après le pic d'élution doivent être utilisées. La G-actine purifiée conserve généralement une forte activité de polymérisation pendant 2 à 3 semaines lorsqu'elle est conservée sur glace à 4 °C, et peut rester utilisable jusqu'à la quatrième semaine, bien que ses performances diminuent généralement par la suite. Une moindre robustesse des queues en comète, caractérisée par des réseaux d'actine clairsemés et fragiles ainsi qu'une croissance irrégulière des queues, indique souvent une qualité d'actine altérée. Deuxièmement, l'activité des facteurs de nucléation (NPF) détermine de façon critique la formation des queues en comète. Le domaine WCA marqué par une étiquette GST provenant de la protéine humaine du syndrome de Wiskott-Aldrich neuronal (N-WASP) (GST-VCA) disponible dans le commerce fournit une activité de nucléation robuste et durable, et la dimérisation du GST renforce davantage cette activité63. Nous recommandons de valider tout construit NPF à l'aide d'un test de polymérisation de l'actine marquée à la pyrène avant l'immobilisation sur les billes. L'activité du GST-VCA commercial peut servir de norme de référence. Notamment, le GST-VCA commercial utilisé ici ne possède pas de région polyproline et n'interagit donc pas avec les complexes profilines-actine26. Troisièmement, une visualisation fiable de la croissance des queues en comète exige une préparation soigneuse des lames et des lamelles. Nous recommandons de nettoyer soigneusement les lames et les lamelles avec de l'eau et de l'éthanol, suivis d'un nettoyage au plasma immédiatement avant utilisation. Lorsqu'elles sont disponibles, les lamelles silanisées au polyéthylène glycol26 sont préférables car elles minimisent l'adsorption non spécifique des protéines et améliorent la reproductibilité. L'ajout d'une concentration adéquate de BSA dans le mélange de motilité peut davantage réduire les interactions non spécifiques avec la surface et favoriser des performances constantes du test. Quatrièmement, le volume d'échantillon appliqué dans la chambre est critique pour des mesures fiables15,16,17. Un volume d'échantillon excessif entraîne une dérive des billes, empêchant un suivi précis de l'allongement de la queue en comète. En revanche, un volume insuffisant comprime les billes entre la lame et la lamelle, augmentant le frottement et immobilisant les billes. Cette contrainte mécanique peut altérer la morphologie des queues en comète et modifier les cinétiques de croissance mesurées. Par conséquent, l'optimisation à la fois de la hauteur de la chambre et du volume d'échantillon est essentielle pour obtenir des résultats reproductibles. Nous recommandons d'optimiser empiriquement le volume d'échantillon pour chaque configuration expérimentale. Lorsqu'une lamelle de 22 mm × 22 mm est utilisée comme décrit ici, l'ajout de 2,1 à 2,3 µL du mélange de motilité produit une hauteur de chambre d'environ 4,3 µm, permettant un positionnement stable des billes de 2,0 µm de diamètre sans dérive excessive ni compression.&#160;Lorsqu'une lamelle de dimensions différentes est utilisée, le volume d'échantillon doit être ajusté en conséquence afin d'assurer un remplissage uniforme de la chambre, un positionnement stable des billes et une dérive minimale de l'échantillon.
Si des queues de comète ne se forment pas, vérifiez la compétence de la polymérisation de l'actine et l'activité des facteurs de nucléation (NPF). Si la rupture de symétrie ne se produit pas, ajustez la concentration de CP afin de moduler la densité du réseau. Des réseaux excessivement denses résistent à la fracture, tandis que des réseaux trop clairsemés manquent d'intégrité structurelle. Si les billes revêtues de myosine ne montrent aucune différence par rapport aux billes témoins, confirmez la densité de surface de la myosine et l'activité motrice. Pour le contrôle qualité, le critère d'acceptation est fonctionnel et non fondé sur une valeur numérique absolue. Une nouvelle préparation est considérée comme acceptable si,&#160;elle reproduit la formation et la croissance des queues de comète observées avec une préparation précédemment validée (comme illustré dans&#160;Figure 3). En outre, chaque nouvelle préparation de myosine, de complexe Arp2/3, de NPF, de CapZ ou d'actine doit être évaluée à l'aide des tests de contrôle qualité appropriés et comparée à une préparation précédemment validée avant utilisation, afin d'assurer la reproductibilité dans les expériences quantitatives (voir Protocole section 3.1).
Plusieurs limites de ce test doivent être prises en compte lors de l'interprétation des résultats. Premièrement, l'intensité de fluorescence est utilisée comme un indicateur relatif et non étalonné de la densité du réseau d'actine ; par conséquent, les comparaisons ne doivent être effectuées qu'entre des échantillons imagés dans des conditions d'acquisition identiques et analysés à l'aide du même protocole de seuil. Deuxièmement, la mobilité des billes, la croissance des queues en comète et l'efficacité de croissance fournissent des mesures indirectes du comportement du réseau générateur de force, mais ne constituent pas des mesures directes de force. Des mesures mécaniques directes, telles que le piégeage optique ou les tests de déformation de membrane étalonnés en force64,65, sont nécessaires pour quantifier les forces produites par le réseau. Troisièmement, ce test ne permet pas de résoudre directement l'ultrastructure du réseau d'actine, par exemple l'orientation des filaments, la densité de branchement ou l'organisation locale de la myosine.&#160;Des approches complémentaires telles que la microscopie électronique ou l'imagerie super-résolutive peuvent être nécessaires pour la caractérisation de la structure à l'échelle nanométrique&#160;. Enfin, l'utilisation de billes rigides de taille micrométrique fournit une interface simplifiée et facilement manipulable expérimentalement, mais ne rend pas compte de la déformabilité, de l'hétérogénéité de courbure, de la mobilité lipidique ou de la complexité moléculaire des membranes cellulaires. Le développement futur d'interfaces plus proches de la physiologie sera donc essentiel pour étudier la manière dont les composants du cytosquelette s'organisent au niveau du bord antérieur de la cellule.
Dans l'ensemble, cette approche de reconstitution permet un contrôle précis de la composition et de la concentration des protéines, offrant la possibilité d'analyser mécanistiquement des composants individuels de manière difficile à réaliser dans des systèmes cellulaires. Elle fournit une plateforme polyvalente pour étudier la façon dont les moteurs moléculaires remodelent les réseaux d'actine ramifiés et modulent la génération de force à des interfaces semblables à des membranes. Avec une validation appropriée, ce test peut être étendu afin d'examiner comment différentes classes de myosines, des variants mutés ou associés à des maladies, ainsi que des protéines liant l'actine sensibles à la force, régulent la rétroaction mécanique au sein de réseaux d'actine dynamiques. De façon plus générale, ce système contribue à relier l'activité des moteurs à l'échelle moléculaire à l'organisation cytosquelettique et à la fonction mécanique à l'échelle mésoscopique, avec des implications pour la motilité cellulaire, l'endocytose et le remodelage membranaire.

La polymérisation de l'actine ramifiée, médiée par le complexe de protéines apparentées à l'actine 2/3 (Arp2/3), génère les forces protrusives principales qui dirigent divers processus cellulaires, notamment la motilité cellulaire, l'endocytose, la phagocytose et la formation de complexes d'adhésion cellulaire1,2,3,4,5,6. Au bord antérieur des cellules migrantes, les facteurs de promotion de la nucléation (NPF) activent le complexe Arp2/3 au niveau de la membrane plasmique, amorçant l'assemblage d'un réseau d'actine dendritique qui pousse la membrane vers l'avant. Les moteurs myosine-I colocalisent fréquemment avec ces réseaux d'actine ramifiés aux interfaces membranaires et sont impliqués dans la régulation&#160;de l'organisation de l'actine&#160;et la modulation de la génération de force7,8,9,10,11,12,13. Malgré des preuves croissantes indiquant que la myosine-I contribue à des processus mécaniques dépendants de l'actine, les mécanismes moléculaires par lesquels la myosine-I interagit avec l'assemblage d'actine ramifiée médié par Arp2/3 afin de moduler l'architecture du réseau et la production mécanique restent mal compris.
Pour combler cette lacune, nous avons intégré la myosine-I au système bien établi de mobilité de billes portant une queue cométaire d'actine14,15,16,17 afin de reconstituer les interactions entre la myosine-I, l'actine et le complexe Arp2/3 à la surface de billes de taille micrométrique. L'objectif global de cette méthode est d'étudier quantitativement la manière dont le couplage myosine-actine influence l'assemblage de l'actine ramifiée, l'architecture du réseau, la rupture de symétrie et la mobilité des billes à une interface analogue à une membrane. Dans cet essai, la myosine-I et les facteurs de nucléation (NPF) sont co-immobilisées sur des billes microscopiques afin de reproduire leur colocalisation au niveau de la membrane plasmique18. Après l'initiation de la polymérisation, les NPF liés à la surface stimulent l'assemblage de l'actine ramifiée dépendant d'Arp2/3, conduisant à la formation d'une coquille d'actine, à la rupture de symétrie et au développement d'une queue cométaire polarisée&#160;qui propulse la bille14,19,20,21,22,23. En faisant varier systématiquement la densité surfacique de myosine18 et en modulant la densité du réseau d'actine par la concentration de protéine de capuchon (CP)15,19,24, cette méthode permet une analyse quantitative de la cinétique d'assemblage de l'actine, de l'efficacité de croissance, de l'architecture du réseau et de la mobilité des billes, fournissant ainsi des indicateurs indirects liés aux modifications de la production mécanique dépendantes de la myosine-I.
Le test présente également des avantages distincts par rapport aux approches complémentaires. Contrairement aux essais de polymérisation en masse, tels que les essais à base d’actine-pyrène, ce système de mobilité des billes permet une visualisation directe de l’assemblage d’actine ramifiée et du déplacement des billes induit par la polymérisation de l’actine. Contrairement aux études cellulaires, où les fonctions protéiques chevauchantes et les environnements cellulaires complexes peuvent masquer les contributions individuelles et compliquer l’interprétation, ce test offre un contrôle précis sur la composition, la concentration et l’organisation surfacique des protéines, permettant ainsi une investigation systématique de la manière dont la myosine-I interagit avec l’assemblage d’actine médié par Arp2/3 dans des conditions biochimiques définies.
Cette méthode est particulièrement adaptée à l'étude de la coordination des composants du cytosquelette au niveau d'une membrane artificielle&#160;interface permettant de réguler l'architecture du réseau d'actine et sa production mécanique. Bien que le protocole actuel soit optimisé pour l'assemblage de l'actine ramifiée médié par la myosine I, sa conception modulaire pourrait être adaptée à l'avenir pour étudier d'autres classes de myosines associées à la membrane (par exemple, myosine VI, VII, X, XV et XIX) et/ou d'autres protéines liant l'actine (par exemple, les formines, la protéine phospho-régulée par stimulation vasodilatatrice (VASP), la cortactine, la coronine ou la tropomyosine). De telles adaptations nécessiteraient une validation de l'immobilisation des protéines, de leur activité et de leur densité de surface. En outre, le test est compatible avec des stratégies de marquage de type « pulse-chase ». L'incorporation d'actine photoconvertible ou photoactivable, ou de sous-unités d'Arp2/3 marquées, pourrait permettre de mesurer les taux de renouvellement des filaments et de dissociation des branches au sein du réseau en croissance.25Dans l'ensemble, ce dosage offre une plateforme polyvalente pour examiner les interactions moléculaires entre les moteurs associés aux membranes, les filaments d'actine et les protéines liant l'actine, ainsi que pour étudier la manière dont les moteurs et les protéines liant l'actine régulent le remaniement du réseau et la génération de forces aux interfaces de type membranaire.14,15,26,27,28,29,30,31,32,33,34Plus généralement, il constitue également une plateforme minimale et ajustable de matière active pour l'étude des principes physiques sous-jacents aux dynamiques hors équilibre induites par des moteurs moléculaires, tels que la rupture de symétrie, l'auto-organisation, les rétroactions mécanochimiques et d'autres comportements émergents dans les réseaux actomyosiniques actifs.18,19,20,21,22,23,35,36, avec des implications potentielles pour la physique de la matière active et l'ingénierie des matériaux.

<table><tbody><tr><td>Adénosine 5&amp;prime;-triphosphate, sel disodique, hydraté</td><td>Sigma</td><td>A26209</td><td>Utilisé pour préparer des tampons contenant de l'ATP ; aliquoter et conserver à &amp;minus;20&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Complexe Arp2/3</td><td>Préparé en interne</td><td>N/A</td><td>Utilisé pour nucléer les réseaux d'actine ramifiés ; purifié selon la référence 42.</td></tr><tr><td>Colorant fluorescent Biotine-CF640</td><td>Biotium</td><td>80032</td><td>Utilisé pour marquer fluorescentemment les billes témoins ; protéger de la lumière et conserver à &amp;minus;80&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Myo1d biotinylée</td><td>Préparé en interne</td><td>N/A</td><td>Protéine motrice utilisée pour recouvrir les billes de myosine ; préparée comme décrit dans les références 18 et 38&amp;ndash;40.</td></tr><tr><td>Albumine de sérum bovin</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td>Utilisée pour le blocage des billes et les tampons de conservation ; préparer une solution mère filtrée.</td></tr><tr><td>Chlorure de calcium</td><td>Sigma</td><td>C7902</td><td>Constituant du tampon utilisé dans le tampon X et les expériences de perturbation par le calcium.</td></tr><tr><td>Calmoduline</td><td>Préparé en interne</td><td>N/A</td><td>Ajoutée aux réactions contenant de la myosine et au tampon de conservation des billes ; purifiée selon la référence 44.</td></tr><tr><td>Billes de polystyrène carboxylé (diamètre de 2,0 &amp;micro;m)</td><td>Polysciences</td><td>18327-10</td><td>Utilisées comme support solide pour le recouvrement par les facteurs de nucléation (NPF), la NeutrAvidine, le colorant fluorescent et la myosine ; conserver à 4&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Caméra CCD</td><td>Teledyne</td><td>01-RET-R6-R-M-14-C-OC</td><td>Utilisée pour l'acquisition d'images en fluorescence lors de la microscopie en temps réel.</td></tr><tr><td>Coloration au bleu de Coomassie brillant</td><td>Sigma</td><td>B7920</td><td>Utilisée pour colorer les gels SDS-PAGE avant l'analyse densitométrique.</td></tr><tr><td>Lames couvre-objets, 22 mm &amp;times; 22 mm, #1,5</td><td>Globe</td><td>1404-15</td><td>Utilisées avec des lames porte-objets pour assembler les chambres de compression.</td></tr><tr><td>Dithiothréitol (DTT)</td><td>GoldBio</td><td>DTT10</td><td>Réactif réducteur utilisé dans les tampons et les mélanges de motilité ; conserver à &amp;minus;20&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Pompe à vide à spirale sèche</td><td>Agilent Technologies</td><td>IDP3B01</td><td>Utilisée pour faire fonctionner le système de nettoyage au plasma.</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>GoldBio</td><td>E-217-100</td><td>Chélateur de calcium utilisé dans le tampon M, le tampon de motilité et le prétraitement de l'actine.</td></tr><tr><td>Source lumineuse externe</td><td>Leica</td><td>EL6000</td><td>Source lumineuse à halogénure métallique pour la microscopie en fluorescence.</td></tr><tr><td>Fiji (ImageJ)</td><td>Logiciel libre</td><td>N/A</td><td>Utilisé pour l'analyse de la longueur des queues cométaires, de l'intensité de fluorescence et de la densité du réseau (version 2.16.0/1.54p).</td></tr><tr><td>Microscope à fluorescence</td><td>Leica</td><td>DMIRB</td><td>Microscope à épifluorescence inversé utilisé pour l'imagerie des queues cométaires d'actine.</td></tr><tr><td>Acide acétique glacial</td><td>Fisher Chemical</td><td>BP2401-212</td><td>Constituant de la solution de décoloration des gels SDS-PAGE ; corrosif, manipuler avec les précautions appropriées.</td></tr><tr><td>GST-VCA</td><td>Cytoskeleton</td><td>VCG03-A</td><td>Facteur de promotion de la nucléation utilisé pour l'assemblage de l'actine médié par Arp2/3 ; aliquoter et conserver à &amp;minus;80&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>GoldBio</td><td>H-400-1</td><td>Réactif tampon utilisé dans le tampon X, le tampon M et le tampon de motilité.</td></tr><tr><td>CapZ humaine</td><td>Préparé en interne</td><td>N/A</td><td>Protéine de capuchon utilisée pour réguler la densité du réseau d'actine ; purifiée selon la référence 43.</td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium</td><td>Spectrum Chemical</td><td>M1035</td><td>Constituant du tampon utilisé dans les tampons de réaction et le prétraitement de l'actine.</td></tr><tr><td>Logiciel d'imagerie MetaMorph</td><td>Molecular Devices</td><td>N/A</td><td>Utilisé pour la commande du microscope et l'acquisition d'images (version 7.10.4.459).</td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>Sigma</td><td>MX0485-3</td><td>Constituant de la solution de décoloration des gels SDS-PAGE ; inflammable, manipuler conformément aux procédures de sécurité institutionnelles.</td></tr><tr><td>Méthylcellulose</td><td>Sigma</td><td>M0387</td><td>Ajoutée au tampon de motilité pour augmenter la viscosité de la solution (1500 cP).</td></tr><tr><td>Lames porte-objets</td><td>Corning</td><td>2947-75X25</td><td>Utilisées pour assembler les chambres de compression en microscopie.</td></tr><tr><td>Protéine NeutrAvidine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31000</td><td>Utilisée pour l'immobilisation de protéines biotinylées sur les surfaces des billes ; aliquoter et conserver à &amp;minus;80&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Marqueur protéique précoloré PageRuler Plus</td><td>Thermo Scientific</td><td>26619</td><td>Marqueur de poids moléculaire utilisé pour l'analyse SDS-PAGE ; conserver à &amp;minus;20&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Nettoyeur au plasma</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-32G</td><td>Utilisé pour nettoyer au plasma les lames porte-objets et les lames couvre-objets avant l'assemblage de la chambre.</td></tr><tr><td>Filtre à seringue en polyéthersulfone, 0,22 &amp;micro;m</td><td>Sigma</td><td>SLGPR33RS</td><td>Utilisé pour filtrer la solution mère d'albumine de sérum bovin avant l'aliquotage.</td></tr><tr><td>Chlorure de potassium</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP366-1</td><td>Sel utilisé pour maintenir la force ionique dans les tampons d'essai.</td></tr><tr><td>Actine de muscle squelettique de lapin</td><td>Préparé en interne</td><td>N/A</td><td>Purifiée selon la référence 41 et utilisée comme G-actine dans les essais d'assemblage des queues cométaires d'actine.</td></tr><tr><td>Microcentrifugeuse réfrigérée</td><td>Eppendorf</td><td>EP-5415R</td><td>Utilisée pour la pelletisation des billes lors de la préparation et des étapes de lavage des billes.</td></tr><tr><td>Agitateur rotatif (rotateur de paillasse)</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-04397-40</td><td>Utilisé pendant les incubations de recouvrement des billes pour maintenir la suspension des billes.</td></tr><tr><td>Tampon de migration Tris/Glycine/SDS (10&amp;times;)</td><td>Bio-Rad</td><td>1610732</td><td>Diluer à 1&amp;times; avant l'électrophorèse SDS-PAGE.</td></tr><tr><td>Gras à vide</td><td>High Vac Depot</td><td>408524</td><td>Utilisé pour sceller les chambres de compression avant l'imagerie en fluorescence.</td></tr><tr><td>Gel SDS-polyacrylamide en gradient 4%&amp;ndash;20%</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>XP04205BOX</td><td>Utilisé pour l'analyse SDS-PAGE des protéines associées aux billes ; conserver à 4&amp;deg;C.</td></tr></tbody></table>

reconstitution de l'assemblage de l'actine branchée médié par la myosine-i dans un essai de motilité de queues de comètes d'actine basé sur des billes

Reconstituting Myosin-I-Mediated Branched Actin Assembly in a Bead-Based Actin Comet-Tail Motility Assay

La polymérisation de l'actine ramifiée, médiée par le complexe de protéines apparentées à l'actine 2/3 (Arp2/3), fournit les principales forces propulsives pour divers processus cellulaires, notamment la migration cellulaire, l'endocytose et la phagocytose. Les moteurs myosine-I, qui colocalisent fréquemment avec les réseaux d'actine ramifiée au bord antérieur de la cellule, ont également été impliqués dans ces processus et sont supposés réguler l'organisation du réseau d'actine et sa production mécanique. Toutefois, les mécanismes moléculaires par lesquels la myosine-I interagit avec le complexe Arp2/3 afin de moduler l'assemblage de l'actine ramifiée et la génération de force restent largement inconnus. Ici, nous décrivons un dosage in vitro de mobilité de billes portant une queue cométaire d'actine, hautement ajustable, qui reconstitue les interactions entre la myosine-I, l'actine et le complexe Arp2/3 au niveau du bord antérieur cellulaire, à la surface de billes de taille micrométrique. Cette méthode, dérivée de dosages bien établis de queues cométaires d'actine, consiste à immobiliser conjointement la myosine-I et les facteurs de promotion de la nucléation (NPF) sur la surface des billes, créant ainsi une interface d'assemblage de l'actine analogue à une membrane. Ce dosage permet la visualisation et l'analyse quantitative de l'assemblage du réseau d'actine, de la densité du réseau, de la mobilité des billes et de l'efficacité de croissance. Il fournit également des indicateurs indirects et qualitatifs du renforcement de la force induit par la myosine-I dans les réseaux d'actine ramifiée. Ce protocole inclut la fonctionnalisation des billes, l'assemblage des réactions, l'imagerie en fluorescence, l'analyse quantitative des images et des stratégies de dépannage, offrant ainsi une plateforme reproductible pour l'étude de l'assemblage de l'actine régulé par la myosine-I à des interfaces analogues à la membrane.

Ce protocole décrit un essai de motilité de perles à queue cométaire d'actine ajustable permettant d'étudier quantitativement la manière dont l'activité du moteur myosine influence l'assemblage de l'actine ramifiée et l'architecture du réseau à une interface de type membranaire.

Reconstitution de l'assemblage de l'actine branchée médié par la myosine-I dans un essai de motilité de queues de comètes d'actine basé sur des billes

La polymérisation ramifiée de l'actine, médiée par le complexe protéique Arp2/3 (actin-related protein 2/3), fournit les principales forces de poussée pour une variété de processus cellulaires...

Our research focuses on studying how myosin-I shapes branched actin networks and drives force generation at membrane interfaces. Previous cellular studies make it hard to isolate myosin-I effects. This protocol reconstitutes everything in vitro under well-controlled conditions.To begin, gather the required reagents. After preparing the nucleation-promoting factor, or NPF, and neutravidin coating mixture, gently mix the coating mixture by pipetting up and down 5 to 10 times, avoiding bubble formation. Transfer 5 microliters of bead slurry to a microcentrifuge tube. Add 10 microliters of X buffer to the beads and pipette at least five times. Pellet the beads by centrifugation at 16,000 x g for two minutes at 4 degrees Celsius. Carefully remove the supernatant by tilting the tube and aspirating from the side opposite the bead pellet. Resuspend the washed beads in 50 microliters of the previously prepared coating mixture. Mix the suspension by gentle pipetting and leave a small air bubble to facilitate mixing during incubation. Incubate the beads on a benchtop rotator at 20 revolutions per minute for two hours at 4 degrees Celsius. Pellet the beads by centrifugation at 16,000 x g for two minutes at 4 degrees Celsius, and carefully remove the supernatant containing excess neutravidin and GST-VCA. Resuspend the coated beads in 200 to 400 microliters of 10 milligrams per milliliter BSA. Incubate the suspension on ice for 30 minutes to block unoccupied binding sites on the bead surface. Pellet the beads by centrifugation at 16,000 x g for two minutes at 4 degrees Celsius, and carefully remove the supernatant. Resuspend the beads in 50 microliters of 1 milligram per milliliter BSA prepared in X buffer. Pellet the beads by centrifugation at 16,000 x g for two minutes at 4 degrees Celsius. Remove the supernatant and repeat the wash twice. Store the coated beads in 1 milligram per milliliter BSA prepared in X buffer on ice and use them within one week.To exchange the storage X buffer with the M buffer before myosin coating, divide 50 microliters of neutravidin-NPF-coated beads equally into two microcentrifuge tubes. Pellet the beads by centrifugation at 16,000 x g for two minutes at 4 degrees Celsius and carefully remove the supernatant. Wash the beads with 25 microliters of 1 milligram per milliliter BSA prepared in M buffer. Pellet the beads by centrifugation at 16,000 x g for two minutes at 4 degrees Celsius. Carefully remove the supernatant and repeat the wash twice. Resuspend the control beads in 25 microliters of 1 micromolar Biotin-CF640 fluorescent dye diluted from the stock solution in M buffer. Resuspend the myosin beads in 25 microliters of 500 nanomolar to 1 micromolar biotinylated myosin supplemented with 1 to 5 micromolar calmodulin. After covering the tubes with aluminum foil, incubate the bead suspensions on ice for at least 30 minutes. Pellet the beads by centrifugation at 16,000 x g for two minutes at 4 degrees Celsius, and carefully remove the supernatant containing excess biotinylated myosin or fluorescent dye. Wash the decorated beads with 25 microliters of 1 milligram per milliliter BSA prepared in M buffer. Pellet the beads by centrifugation at 16,000 x g for two minutes at 4 degrees Celsius. Carefully remove the supernatant and repeat the wash twice. Supplement the myosin-decorated beads with 1 to 5 micromolar calmodulin. Protect all decorated beads from light by covering the tubes with aluminum foil, then store the far-red fluorescent dye-decorated beads or myosin-decorated beads on ice.After bead preparation and decoration, prepare a 50-microliter motility mixture. Initiate the reaction by adding 4 microliters of 50 micromolar G-actin with 5% to 10% of the actin fluorescently labeled. Mix the reaction immediately and designate this time point as time equals 0. Clean the glass slide and coverslip with 70% ethanol, followed by deionized water. Plasma-clean the glass surfaces using ambient air plasma for 10 minutes. Apply 2.3 microliters of the reaction mixture to the glass slide. Place a 22-millimeter by 22-millimeter coverslip over the sample to form a squeeze chamber, with an approximate chamber height of 4.3 micrometers. Seal the chamber with vacuum grease. Using an epifluorescence microscope, acquire fluorescence images.Surface-bound NPFs stimulated branched actin assembly around the bead surface and actin first appeared as a sparse shell surrounding the bead. Continued actin assembly at the bead surface drove outward network growth, which led to symmetry breaking and the formation of a polarized comet tail. Once a comet tail was established, ongoing actin nucleation at the bead surface supported sustained bead movement. Under standard assay conditions, myosin-coated beads typically produce dimmer, sparser, or more diffuse actin comet tails than control beads.This protocol allows researchers to study how membrane-bound myosin motors regulate actin network density, growth kinetics, and polymerization-driven bead movement. The most important consideration is protein quality. Always validate new preparations against a previously validated batch before quantitative experiments. Future studies building on this work can test other membrane-associated myosins, disease-associated motor variants, or actin regulators at the membrane-like interface.

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