ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Chen, S., Zhu, H., Jounaidi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+snapshots+of+natural+killer+cells+functions%2C+signaling%2C+molecular+mechanisms+and+clinical+utilization%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduct+Target+Ther%22%5BJournal%5D)">Comprehensive snapshots of natural killer cells functions, signaling, molecular mechanisms and clinical utilization.</a> Signal Transduct Target Ther. , (2024).</li>
<li>Liesche, C., Sauer, P., Prager, I., Urlaub, D., Claus, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-fluorescent+protein+reporters+allow+parallel+quantification+of+natural+killer+cell-mediated+granzyme+and+caspase+activities+in+single+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Single-fluorescent protein reporters allow parallel quantification of natural killer cell-mediated granzyme and caspase activities in single target cells.</a> Front Immunol. , (2018).</li>
<li>Hartmann, J. A., Cardoso, M. R., Talarico, M. C. R., Kenney, D. J., Leone, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evasion+of+NKG2D-mediated+cytotoxic+immunity+by+sarbecoviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Evasion of NKG2D-mediated cytotoxic immunity by sarbecoviruses.</a> Cell. , (2024).</li>
<li>Garcia-Beltran, W. F., Hölzemer, A., Martrus, G., Chung, A. W., Pacheco, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open+conformers+of+HLA-F+are+high-affinity+ligands+of+the+activating+NK-cell+receptor+KIR3DS1%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Open conformers of HLA-F are high-affinity ligands of the activating NK-cell receptor KIR3DS1.</a> Nat Immunol. , (2016).</li>
<li>Rezvani, K., Rouce, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+application+of+natural+killer+cell+immunotherapy+for+the+treatment+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">The application of natural killer cell immunotherapy for the treatment of cancer.</a> Front Immunol. , (2015).</li>
<li>Coënon, L., Villalba, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+CD16a+biology+to+antibody-dependent+cell-mediated+cytotoxicity+improvement%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">From CD16a biology to antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity improvement.</a> Front Immunol. , (2022).</li>
<li>Ruggeri, L., Mancusi, A., Capanni, M., Martelli, M. F., Velardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploitation+of+alloreactive+NK+cells+in+adoptive+immunotherapy+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Exploitation of alloreactive NK cells in adoptive immunotherapy of cancer.</a> Curr Opin Immunol. , (2005).</li>
<li>Liu, E., Marin, D., Banerjee, P., Macapinlac, H. A., Thompson, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+CAR-transduced+natural+killer+cells+in+CD19-positive+lymphoid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Use of CAR-transduced natural killer cells in CD19-positive lymphoid tumors.</a> N Engl J Med. , (2020).</li>
<li>Li, Y., Hermanson, D. L., Moriarity, B. S., Kaufman, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+iPSC-derived+natural+killer+cells+engineered+with+chimeric+antigen+receptors+enhance+anti-tumor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Human iPSC-derived natural killer cells engineered with chimeric antigen receptors enhance anti-tumor activity.</a> Cell Stem Cell. , (2018).</li>
<li>Marin, D., Li, Y., Basar, R., Rafei, H., Daher, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety%2C+efficacy+and+determinants+of+response+of+allogeneic+CD19-specific+CAR-NK+cells+in+CD19%2B+B+cell+tumors%3A+a+phase+1%2F2+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Safety, efficacy and determinants of response of allogeneic CD19-specific CAR-NK cells in CD19+ B cell tumors: a phase 1/2 trial.</a> Nat Med. , (2024).</li>
<li>Chava, S., Bugide, S., Gupta, R., Wajapeyee, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+natural+killer+cell-mediated+cytotoxicity+and+migration+in+the+context+of+hepatic+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Measurement of natural killer cell-mediated cytotoxicity and migration in the context of hepatic tumor cells.</a> J Vis Exp. (156), e60714(2020).</li>
<li>Liu, E., Tong, Y., Dotti, G., Shaim, H., Savoldo, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cord+blood+NK+cells+engineered+to+express+IL-15+and+a+CD19-targeted+CAR+show+long-term+persistence+and+potent+antitumor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Cord blood NK cells engineered to express IL-15 and a CD19-targeted CAR show long-term persistence and potent antitumor activity.</a> Leukemia. , (2018).</li>
<li>Mensali, N., Dillard, P., Hebeisen, M., Lorenz, S., Theodossiou, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NK+cells+specifically+TCR-dressed+to+kill+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EBioMedicine%22%5BJournal%5D)">NK cells specifically TCR-dressed to kill cancer cells.</a> EBioMedicine. , (2019).</li>
<li>Nowak, J., Bentele, M., Kutle, I., Zimmermann, K., Lühmann, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR-NK+cells+targeting+HER1+%28EGFR%29+show+efficient+anti-tumor+activity+against+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma+%28HNSCC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">CAR-NK cells targeting HER1 (EGFR) show efficient anti-tumor activity against head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC).</a> Cancers (Basel). , (2023).</li>
<li>Granger, J. E., Appledorn, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+measurement+of+apoptosis+and+immune+cell+killing+using+live-cell+imaging+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Kinetic measurement of apoptosis and immune cell killing using live-cell imaging and analysis.</a> Methods Mol Biol. , (2021).</li>
<li>Duffy, J., Rider, A., Loneman, D., Thakkar, D., Mullen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALK%2B+LBCL+and+PBL+share+a+similar+plasmablastic+transcriptional+identity+but+show+divergent+signaling+dependencies+and+therapeutic+vulnerabilities%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">ALK+ LBCL and PBL share a similar plasmablastic transcriptional identity but show divergent signaling dependencies and therapeutic vulnerabilities.</a> Blood. , (2025).</li>
<li>Kandarian, F., Sunga, G. M., Arango-Saenz, D., Rossetti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+flow+cytometry-based+cytotoxicity+assay+for+the+assessment+of+human+NK+cell+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A flow cytometry-based cytotoxicity assay for the assessment of human NK cell activity.</a> J Vis Exp. (126), e56191(2017).</li>
<li>Klingemann, H., Boissel, L., Toneguzzo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+killer+cells+for+immunotherapy+-+advantages+of+the+NK-92+cell+line+over+blood+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Natural killer cells for immunotherapy - advantages of the NK-92 cell line over blood NK cells.</a> Front Immunol. , (2016).</li>
<li>Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD107a+as+a+functional+marker+for+the+identification+of+natural+killer+cell+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity.</a> J Immunol Methods. , (2004).</li>
<li>Valiante, N. M., Uhrberg, M., Shilling, H. G., Lienert-Weidenbach, K., Arnett, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionally+and+structurally+distinct+NK+cell+receptor+repertoires+in+the+peripheral+blood+of+two+human+donors%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Functionally and structurally distinct NK cell receptor repertoires in the peripheral blood of two human donors.</a> Immunity. , (1997).</li>
<li>Wang, Y., Zhang, Y., Hughes, T., Zhang, J., Caligiuri, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fratricide+of+NK+cells+in+daratumumab+therapy+for+multiple+myeloma+overcome+by+ex+vivo-expanded+autologous+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Fratricide of NK cells in daratumumab therapy for multiple myeloma overcome by ex vivo-expanded autologous NK cells.</a> Clin Cancer Res. , (2018).</li>
<li>Cichocki, F., Bjordahl, R., Gaidarova, S., Mahmood, S., Abujarour, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iPSC-derived+NK+cells+maintain+high+cytotoxicity+and+enhance+in+vivo+tumor+control+in+concert+with+T+cells+and+anti-PD-1+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">iPSC-derived NK cells maintain high cytotoxicity and enhance in vivo tumor control in concert with T cells and anti-PD-1 therapy.</a> Sci Transl Med. , (2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Advanced RPMI-1640 medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12633020</td><td>Milieu de base pour les milieux de culture de cellules NK-92 et de cellules NK humaines primaires (voir le protocole pour la formulation complète)</td></tr><tr><td>Anti-human CD107a antibody, PE-Cy7 conjugated (clone H4A3)</td><td>BioLegend</td><td>328618</td><td>Marqueur de dégranulation pour la cytométrie en flux</td></tr><tr><td>Anti-human CD16 antibody, BV785 conjugated (clone 3G8)</td><td>BioLegend</td><td>302046</td><td>Cytométrie en flux</td></tr><tr><td>Anti-human CD56 antibody, BV421 conjugated (clone HCD56)</td><td>BioLegend</td><td>318328</td><td>Cytométrie en flux</td></tr><tr><td>Centrifugeuse de bureau avec rotor à godets compatible avec les tubes de 15 ml et les plaques à 96 puits (Centrifugeuse Eppendorf 5810R)</td><td>Eppendorf</td><td>5811000015</td><td>Utilisée pour le pelletage cellulaire et la centrifugation des plaques (100&ndash;300 &times; g)</td></tr><tr><td>Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C34554</td><td>Colorant de prolifération cellulaire pour le marquage des cellules cibles</td></tr><tr><td>Cytomètre à flux spectral Cytek Aurora (ou équivalent)</td><td>Cytek Biosciences</td><td>N7-00003</td><td>Utilisé pour l'acquisition et l'analyse en cytométrie en flux</td></tr><tr><td>DAPI (4&prime;,6-diamidino-2-phénylindole)</td><td>BioLegend</td><td>422801</td><td>Colorant nucléaire pour la discrimination vivant/mort</td></tr><tr><td>Plaques à 96 puits à fond plat</td><td>USA Scientific</td><td>1896-2110</td><td>Utilisées pour la préparation des anticorps</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP231-100</td><td>Réactif de cryopréservation</td></tr><tr><td>Sérum bovin fœtal (FBS)</td><td>Avantor</td><td>76419-584</td><td>Supplément des milieux de base ; utilisé dans le tampon FACS (FBS 2 %)</td></tr><tr><td>Bain-marie polyvalent, 10 L (37 &deg;C)</td><td>PolyScience</td><td>WBE10</td><td>Pour la décongélation des cellules</td></tr><tr><td>GlutaMAX (complément de L-alanyl-L-glutamine)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td>Source stable de glutamine</td></tr><tr><td>Sérum AB humain</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4522-100ML</td><td>Supplément pour les milieux de culture de cellules NK humaines primaires</td></tr><tr><td>Système d'imagerie en direct des cellules vivantes IncuCyte SX5</td><td>Sartorius</td><td>4816</td><td>Imagerie en direct des cellules vivantes en temps réel et analyse cellule par cellule</td></tr><tr><td>Compteur de cellules à double fluorescence LUNA-FL (ou équivalent)</td><td>Logos Biosystems</td><td>L20001</td><td>Dénombrage automatisé des cellules</td></tr><tr><td>Parafilm M (rouleau de 4 po &times; 250 pi)</td><td>Genesee</td><td>16-101</td><td>Scellage et stockage des plaques</td></tr><tr><td>Tampon phosphate-buffered saline (PBS), stérile (pH 7,2&ndash;7,4)</td><td>Corning</td><td>21-020-CV</td><td>Utilisé pour les lavages et la préparation du tampon FACS</td></tr><tr><td>Poly-D-lysine (0,1 mg/mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A3890401</td><td>Réactif de revêtement de plaques</td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pm-2</td><td>Antibiotique</td></tr><tr><td>Interleukine-2 (IL-2) humaine recombinante</td><td>R&amp;D Systems</td><td>202-IL-500</td><td>Cytokine</td></tr><tr><td>Kit d'enrichissement des cellules NK humaines RosetteSep</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>15065</td><td>Cocktail d'enrichissement des cellules NK humaines</td></tr><tr><td>SYTOX Orange dead cell stain</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S34861</td><td>Colorant de viabilité pour l'imagerie des cellules vivantes</td></tr><tr><td>Trypan Blue 0,4 %</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td>Colorant de viabilité pour le dénombrement des cellules</td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme (1X), sans phénol rouge</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12604039</td><td>Pour le détachement des cellules adhérentes</td></tr><tr><td>UltraPure EDTA (0,5 M, pH 8,0)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15575020</td><td>Utilisé pour la préparation du tampon FACS</td></tr><tr><td>Tubes de centrifugation à fond conique de 15 ml</td><td>Corning</td><td>352097</td><td>Stérile</td></tr><tr><td>Plaques de culture tissulaire à 24 puits (traitées pour la culture tissulaire)</td><td>Corning</td><td>3524</td><td>Utilisées pour la récupération des cellules NK</td></tr><tr><td>Plaques à 96 puits à fond rond transparent (traitées pour la culture tissulaire)</td><td>Corning</td><td>3799</td><td>Utilisées pour les essais de co-chercher et de cytométrie en flux</td></tr><tr><td>Plaques à 96 puits à fond plat transparent noir en polystyrène (traitées pour la culture tissulaire)</td><td>Corning</td><td>3603</td><td>Compatible avec les systèmes d'imagerie des cellules vivantes</td></tr></tbody></table>

quantification de la cytotoxicité des cellules nk potentialisée par des récepteurs antigéniques chimériques et des anticorps thérapeutiques à l’aide d’imagerie à cellules vivantes et de cytométrie en flux

Quantifying NK-Cell Cytotoxicity Potentiated by Chimeric Antigen Receptors and Therapeutic Antibodies Using Live-Cell Imaging and Flow Cytometry

Quantification de la cytotoxicité des cellules NK potentialisée par des récepteurs antigéniques chimériques et des anticorps thérapeutiques à l’aide d’imagerie à cellules vivantes et de cytométrie en flux

Natural killer (NK) cells are innate lymphocytes that play a critical role in protective immunity against diverse intracellular pathogens and cancers. ...

Notre laboratoire étudie le rôle des cellules tueuses naturelles dans la santé et la maladie, dans le but d'exploiter leur potentiel afin d'améliorer les traitements contre les cancers solides et hématologiques. Les dosages actuels de cytotoxicité des cellules NK manquent de normalisation entre les différentes plateformes et configurations expérimentales. Ce protocole propose des méthodes reproductibles d'imagerie en cellules vivantes et de cytométrie en flux pour une évaluation précise de la cytotoxicité.Pour commencer, préparez 10 millilitres de SYTOX Orange 2x en diluant la solution mère de SYTOX Orange dans le milieu de culture NK-92 dans un tube conique de 15 millilitres à fond conique. Comptez les cellules cibles à l’aide d’un compteur Luna après les avoir mélangées au bleu de Trypan ou utilisez toute méthode de comptage cellulaire validée basée sur l’exclusion de colorant. Transférez la quantité requise de cellules cibles dans un tube conique de 15 millilitres à fond conique.Centrifuger le tube à 300G pendant cinq minutes à température ambiante et éliminer le surnageant. Ensuite, re-suspendre les cellules cibles à une concentration finale de 250 000 cellules par millilitre dans un milieu contenant du SYTOX Orange 2X. Pour préparer la cellule effettrice, évaluer la viabilité et la concentration des cellules NK-92, et poursuivre uniquement si la viabilité est supérieure à 80 %, car une viabilité plus faible pourrait affecter la performance du test.Compter et transférer le nombre requis de cellules NK-92 dans des tubes coniques individuels de 15 millilitres. Après centrifugation, re-suspendre les cellules à une concentration finale de 500 000 cellules par millilitre. Préparer les dilutions de cellules effectrices en ajoutant 240 microlitres de cellules effectrices dans les puits d'une plaque de 96 puits à fond rond pour un rapport effecteur:cible de deux pour un, et ajouter 120 microlitres de milieu dans les puits restants.Réalisez des dilutions sérielles par deux, allant de deux à un à 0,25 à un (effecteur sur cible), en mélangeant soigneusement par pipetage au moins cinq fois et en changeant les embouts entre chaque transfert. Ensuite, pour installer la co-culture, récupérez la plaque de 96 puits à fond plat revêtue de polylysine. Juste avant le transfert, resuspendez soigneusement les cellules cibles et effectrices sans créer de bulles, puis ajoutez 100 microlitres de chaque suspension cellulaire dans les puits appropriés.Ensuite, ajoutez 200 microlitres de PBS dans les puits inutilisés environnants. Faites centrifuger la plaque à 100 × g pendant deux minutes à température ambiante. Placez la plaque dans le système d'imagerie de cellules vivantes.Acquérez des images toutes les heures pendant 24 heures à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone. Vérifiez la qualité des images après le premier balayage et ajustez les paramètres d'acquisition si nécessaire. Ajustez la séparation spectrale afin de corriger le recouvrement de SYTOX Orange dans le canal vert.Vérifiez que les cellules mortes positives oranges ne soient pas identifiées par erreur comme des cellules positives vertes. Pour configurer l'analyse cellule par cellule de cellules non adhérentes, réglez le diamètre attendu de l'objet à 15 micromètres afin de correspondre au diamètre cellulaire approximatif. Réglez la sensibilité du seuil et la sensibilité de la texture à cinq, et la sensibilité des bords à 10 pour faciliter la séparation des agrégats cellulaires.Définissez la plage du filtre de surface d'objet accepté entre 50 et 2 000 micromètres carrés afin d'exclure les débris et les objets de grande taille. Réglez l'excentricité maximale à 0,95 pour exclure les objets non cellulaires. Obtenez des cellules NK humaines primaires cultivées pendant 16 à 24 heures.Transférez 500 000 cellules cibles dans un tube conique de centrifugation de 15 millilitres. Lavez les cellules une fois avec 10 millilitres de PBS. Centrifugez les cellules à 300G pendant cinq minutes à température ambiante.Ensuite, retirez le surnageant. Préparez une solution de travail de 0,5 micromolaire de carboxyfluorescéine succinimidyle ester ou CFSC dans du PBS en diluant un microlitre de solution mère de CFSE à cinq millimolaire dans 10 millilitres de PBS. Resuspendez le culot obtenu à environ un million de cellules par millilitre dans la solution de CFSE.Incuber les cellules pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius, enveloppées dans du papier d'aluminium pour les protéger de la lumière. Ensuite, arrêter la réaction en ajoutant cinq à dix volumes de milieu de culture, puis incuber pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius. Après centrifugation des cellules, re-suspendre le culot cellulaire à raison de 250 000 cellules par millilitre afin que 100 microlitres contiennent 25 000 cellules.Ajoutez 100 microlitres par puits de cellules cibles dans les puits désignés d'une plaque 96 puits à fond rond à l'aide d'une pipette multicanal. Plaquez chaque condition en triple. Ensuite, préparez 200 microlitres de solution d'anticorps 4X dans le milieu de culture des cellules NK pour chaque anticorps testé et son contrôle d'isotype apparié.Transférez les solutions d'anticorps dans une plaque à puits profonds. Ajoutez 50 microlitres de solution d'anticorps dans chaque puits contenant les cellules cibles, puis mélangez soigneusement en aspirant et en rejetant au moins cinq fois à l’aide d’une pipette. Ajoutez 50 microlitres de milieu de culture de cellules NK par puits dans les puits témoins sans anticorps et mélangez soigneusement par pipetage.Incuber la plaque de 25 à 30 minutes dans des conditions d'incubation standard. Compter et obtenir 200 000 cellules NK, et poursuivre uniquement si la viabilité est supérieure ou égale à 75 %. Résuspender les cellules à raison de 250 000 cellules par millilitre dans 800 microlitres de milieu de culture de cellules NK humaines primaires. Ajouter 50 microlitres de cellules NK par puits dans les puits correspondants et mélanger soigneusement en pipetant haut et bas au moins cinq fois.Ensuite, pipeter 50 microlitres par puits de milieu de culture dans les puits de contrôle et mélanger soigneusement. Inspecter attentivement la plaque 96 puits à fond rond pour s'assurer que tous les puits contiennent 200 microlitres avec des niveaux de ménisque uniformes et sans bulles. Centrifuger la plaque pendant deux minutes à 100G, puis l'incuber pendant 16 à 18 heures dans des conditions d'incubation standard.Centrifuger la plaque pendant cinq minutes à 300G et éliminer le surnageant. Laver tous les puits avec 200 microlitres par puits de tampon de tri par cytométrie en flux ou tampon FACS. Préparer un mélange maître d'anticorps de surface dans du tampon FACS comme indiqué ici.Resuspendez les cellules dans 50 microlitres par puits de mélange maître d'anticorps et mélangez soigneusement en aspirant et en expulsant au moins cinq fois à l’aide d’une pipette. Incubez la plaque pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius, enroulée dans du papier d’aluminium pour la protéger de la lumière. Ajoutez 150 microlitres par puits de tampon FACS.Après la centrifugation, resuspendre les cellules dans 100 microlitres par puits de DAPI à cinq micromoles dans du tampon FACS. Passer immédiatement à l'acquisition en cytométrie en flux sans incubation préalable à l'acquisition. Réaliser la cytométrie en flux à l'aide de l'instrument Cytek Aurora et enregistrer les canaux de fluorescence pour CFSE, BV421, BV785, PE-Cy7, DAPI et tout autre fluorochrome supplémentaire.Pendant la co-culture, les cellules effectrices, les cellules cibles vivantes et les cellules mortes ont été visualisées à l'aide d'une microscopie en temps réel de cellules vivantes. Les cellules NK-92 exprimant CAR2 et CAR3 ont présenté une cinétique de destruction plus rapide que les cellules CAR1-NK-92, en particulier aux premiers points temporels et à un rapport effecteur:cible égal. La destruction des cellules cibles a augmenté avec des rapports effecteur:cible plus élevés, y compris pour les cellules NK-92 de contrôle, qui ont démontré une cytotoxicité naturelle.Les cellules NK-92 exprimant CAR2 et CAR3 ont démontré une plus grande puissance à des rapports effecteurs sur cibles plus faibles aux points temporels ultérieurs. Une puissance accrue à des rapports effecteurs sur cibles intermédiaires a été observée aux points temporels plus précoces. Trois paramètres, KR50, KT50 et IKI-50, ont été définis afin de quantifier la puissance des cellules CAR-NK-92, la cinétique de lyse et la performance cytotoxique globale au sein des populations d'effecteurs.L'ajout de daratumumab seul n'a pas réduit la survie des cellules cibles, confirmant que l'anticorps n'avait aucun effet direct sur la viabilité des cellules cibles en l'absence de cellules effectrices. La co-culture avec les cellules NK seules a réduit la survie des cellules cibles à environ 70 %, indiquant une cytotoxicité naturelle de base. L'ajout de daratumumab a davantage réduit la survie cellulaire à environ 37 %, en accord avec une cytotoxicité médiée par les anticorps renforcée.En revanche, la condition contrôle d'isotype a montré une survie d'environ 62 %, comparable à celle de la condition NK seule. La dégranulation des cellules NK était la plus faible dans la co-culture de cellules NK et de cellules cibles sans anticorps, et la plus élevée dans la condition traitée au daratumumab, à environ 31 %, tandis que le contrôle d'isotype présentait une dégranulation intermédiaire d'environ 19 %. Ce protocole permet aux chercheurs de quantifier la cytotoxicité naturelle des cellules NK, d'évaluer la puissance de destruction tumorale de conceptions de CAR-NK, et de comparer l'efficacité de la cytotoxicité cellulaire dépendante des anticorps (ADCC) d'anticorps monoclonaux. Une considération essentielle lors de l'exécution de ce protocole est de maintenir un comptage, un pipetage et un ensemencement précis et constants des cellules NK et des cellules cibles afin d'obtenir des résultats fiables et interprétables.De futures études pourront s'appuyer sur ces protocoles pour explorer l'évasion immunitaire des cellules NK, comparer la susceptibilité tumorale et évaluer de nouvelles immunothérapies basées sur les cellules NK dans divers cancers.

quantifying-nk-cell-cytotoxicity-potentiated-chimeric-antigen

Research

Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Cette vidéo démontre l’activité lytique des cellules tueuses naturelles contre les cellules cibles colorées par fluorescence. La méthode permet de mesurer la cytotoxicité induite par les cellules NK en colorant les cellules mortes et en utilisant un cytomètre en flux pour quantifier les cellules cibles vivantes et mortes.

Préparation d’un échantillon pour un test de cytotoxicité à médiation cellulaire tueuse naturelle pour l’analyse cytométrique en flux

Nous décrivons une cellule unique à haut débit essai pour mesurer la cytotoxicité des lymphocytes T lorsqu'ils sont incubés avec les cellules cibles tumorales. Ce procédé utilise une matrice élastomère dense, de puits sous-nanolitres (~ 100.000 puits / matrice) à l'espace confiner les cellules T et les cellules cibles à des rapports définis et est couplée à la microscopie par fluorescence pour surveiller effecteur-cible conjugaison et l'apoptose subséquente.

Quantitative à haut débit Test de cytotoxicité cellulaire unique pour les cellules T

Ce protocole décrit un test de cytotoxicité sensible basé sur des cellules. En énumérant la diminution de la fréquence des lymphocytes T CD4+ cibles vivantes en présence d’un nombre croissant de lymphocytes T CD8+ effecteurs, ce test permet d’évaluer directement l’activité cytolytique des lymphocytes T CD8+ spécifiques de l’antigène.

Test de cytométrie en flux cellulaire pour mesurer l’activité cytotoxique

Une méthode simple et fiable est décrit ici pour analyser un ensemble de fonctions des cellules NK telles que la dégranulation, la cytokine et la production de chimiokines dans les différents sous-ensembles de cellules NK.

Cytométrie de flux à base de test pour la surveillance des cellules NK Fonctions

Ce travail décrit un flux de travail avancé pour la détermination précise et rapide du nombre de cellules NK (Natural Killer) et de la cytotoxicité des cellules NK dans des échantillons de sang humain.

Cytométrie en flux Analyse des cellules tueuses naturelles lytique Activité dans le sang humain

Une méthode axée sur la cytométrie de flux pour déterminer quantitativement l’activité cytotoxique des humains les cellules tueuses naturelles est montrée ici.

Un test de cytotoxicité axée sur la cytométrie de flux pour l’évaluation de l’activité des cellules NK humaine

Nous décrivons un système d'essai in vitro quantitatif de cytolyse en temps réel pour évaluer la puissance des cellules De T de récepteur d'antigène chimérique ciblant les cellules tumorales liquides et pleines. Ce protocole peut être étendu pour évaluer d'autres cellules effectrices immunitaires, ainsi que des traitements combinés.

Un analyse de puissance en temps réel pour les cellules T de récepteur d'antigène chimérique ciblant les cellules cancéreuses solides et hématologiques

Un protocole pour évaluer la destruction quantitative des cellules tumorales par les cellules de Jurkat exprimant le récepteur de l’antigène chimérique (CAR) ciblant l’antigène tumoral unique. Ce protocole peut être utilisé comme plate-forme de criblage pour l’optimisation rapide des constructions de charnières CAR avant la confirmation dans les lymphocytes T dérivés du sang périphérique.

Évaluation rapide de la cytotoxicité in vitro du récepteur de l’antigène chimérique exprimant le jurkat à l’aide de l’imagerie fluorescente

Ici, nous présentons une méthode pour identifier les composés qui modulent le mécanisme ADCC, un mécanisme important de destruction des cellules cancéreuses des anticorps antitumoraux. L’effet cytotoxique des cellules NK est mesuré dans les sphéroïdes des cellules cancéreuses du sein en présence de trastuzumab. L’analyse d’images permet d’identifier les cellules tueuses et cibles vivantes et mortes dans les sphéroïdes.

Quantification de la cytotoxicité cellulaire dépendante des anticorps dans un modèle sphéroïde tumoral : application à la découverte de médicaments

Ici, nous décrivons une méthode de création de gouttelettes à double émulsion encapsulant un lymphocyte T et une cellule cible cancéreuse afin d’examiner la destruction cellulaire au niveau de la cellule unique. Cette méthode permet une double quantification des molécules cytotoxiques et de l’apoptose des cellules cibles au sein d’une large population de lymphocytes T.

Essai de cytotoxicité basé sur des gouttelettes pour évaluer les lymphocytes T à récepteur de l’antigène chimérique au niveau de la cellule unique

Ragon Institute of Mass General, MIT, and Harvard.  Ce protocole fournit un flux de travail standardisé in vitro. pour une mesure cohérente de la cytotoxicité naturelle, médiée par les récepteurs antigéniques chimériques et dépendante des anticorps des cellules humaines naturelles tueuses grâce à l’imagerie des cellules vivantes et à la cytométrie en flux.

Quantification de la cytotoxicité des cellules NK potentialisée par des récepteurs antigéniques chimériques et des anticorps thérapeutiques à l’aide d’imagerie à cellules vivantes et de cytométrie en flux

Explorer plus de vidéos