Caractérisation fonctionnelle des partenaires pré- et postsynaptiques individuels dans le système nerveux central larvaire de Drosophila à l’aide de CaMPARI

Nos recherches portent sur l’évaluation de la connectivité synaptique fonctionnelle entre partenaires de ganglions neuronaux définis chez des larves vivantes et disséquées de Drosophila. Les méthodes conventionnelles nécessitent une dissection ou une stimulation physique. Ce protocole utilise l’optogénétique chez les larves intactes, réduisant les artefacts.

Pour commencer, faites fondre le médium d’agar-agar-semoule de maïs au micro-ondes pendant 8 à 10 secondes sans faire bouillir, puis laissez-le refroidir à température ambiante sans se solidifier. Avant le refroidissement complet, ajoutez du tout-trans-rétinal, ou ATR, à une concentration de 0,5 millimolaire pour compléter le milieu pour les mouches nécessitant une activation de csChrimson. Couvrez complètement les flacons avec du papier aluminium pour éviter toute exposition à la lumière.

Femelles vierges croisées portant les gènes CaMPARI et csChrimson avec des mâles porteurs des gènes pilotes GAL4 et LexA dans des fioles en plastique contenant le milieu préparé. Préparez des fioles parallèles sans ATR comme témoins. Incubez les fioles à 25 degrés Celsius jusqu’à ce que les larves atteignent le troisième stade d’entrée.

Utilisez un pinceau pour collecter une larve de troisième stade. Rincez la larve dans une plaque micro-ponctuelle à trois puits contenant 0,1 molaire PBS pour enlever toute nourriture adhérante. Placez une petite quantité de pâte à modeler à chaque coin d’une gaine de couverture propre de 18 x 18 millimètres.

Placez la larve dans une goutte de PBS sur la gaine de couverture et laissez-la orienter du côté ventral vers le bas. Placez une lame de microscope propre sur la gaine contenant la larve. Fixez la gaine de couverture en appliquant de la pâte à modeler aux coins, en utilisant juste assez de pression pour immobiliser la larve sans l’écraser ni casser le verre.

Placez la lame contenant la larve sur la scène d’un microscope confocal équipé d’une lentille objective 40x/1,2. Dans l’interface logicielle du microscope, cliquez sur Live. Ensuite, sous le panneau Z Stack, cliquez sur Set First, puis Set Last suivi de Stop pour acquérir une pile Z de neurones postsynaptiques de base, exprimant CaMPARI.

Dans le menu Canaux, réglez le canal vert de 488 nanomètres avec 0,8 % de puissance laser. Ensuite, réglez le canal rouge de 561 nanomètres à 0,8 % de puissance laser. Dans le menu Z Stack, définissez la valeur d’intervalle à 1 micromètre.

Dans le menu Acquisition, choisissez Préréglages pour définir la résolution de 256 x 256 pixels. Une valeur moyenne de ligne de 2, balayage bidirectionnel et vitesse de balayage de 9, permettant une mise à jour automatique du temps des pixels. Effectuer toutes les images dans un environnement sombre, en maintenant les mêmes paramètres d’acquisition tout au long de l’expérience.

Réglez la lumière de photoconversion de 405 nanomètres à 0,5 % de puissance laser. Et la lumière de stimulation optogénétique de 561 nanomètres à 0,8 % de puissance laser. Cliquez sur Live, puis sélectionnez Meilleur ajustement sous le panneau Histogramme.

Laissez les deux lasers stimuler simultanément la larve pendant 30 secondes, puis arrêtez la stimulation. Lors de l’acquisition de ZStack post-stimulation en utilisant les mêmes paramètres que la base, observez la fluorescence rouge de CaMPARI dans les neurones stimulés au laser de larves nourries à ATR avec une photoconversion et des contrôles minimals. Dans le logiciel Fiji ImageJ, cliquez sur Fichier, puis choisissez Ouvrir.

Dans la fenêtre des options d’importation BioFormats avec les paramètres par défaut, cliquez sur OK pour ouvrir l’image ZStack acquise. Dans le menu Image, choisissez Couleur puis Séparer les canaux pour visualiser les canaux rouge et vert de l’image acquise. Pour soustraire l’arrière-plan, cliquez sur Processus, puis sélectionnez Soustraire l’arrière-plan.

Dans la fenêtre pop-up, réglez le rayon de la boule roulante à 50 pixels puis cliquez sur OK et sélectionnez Oui dans la fenêtre Process Stack. Ensuite, dans le menu Analyser, sélectionnez Outils, puis choisissez ROI Manager pour ouvrir la fenêtre ROI. Utilisez l’outil de sélection à main levée pour délimiter les régions d’intérêt autour des cellules individuelles.

Dans la fenêtre ROI, sélectionnez Ajouter pour enregistrer le plan sélectionné. Ensuite, cliquez sur Mesurer pour générer les résultats de surface, moyenne, écart-type et densité intégrée. Répéter le processus pour plusieurs cellules d’une même larve à travers les canaux vert et rouge séparément.

Après avoir exporté les résultats dans un tableur, mesurez le rapport rouge-vert ou R par G des densités intégrées pour chaque cellule, et moyennez ces valeurs pour calculer la moyenne R par rapport par larve pour les images avant et après stimulation. Enfin, calculez le changement de fluorescence ou delta R par G en soustrayant le rapport R par G avant la stimulation du rapport R par G post-stimulation afin de quantifier l’activité calcique post-synaptique. Les études de connectivité fonctionnelle entre les neurones arborisés dendritiques de classe IV ou cIVda et les interneurones du bassin-4 chez les larves du troisième stade ont montré que les interneurones du bassin-4 présentaient une fluorescence verte due à l’expression cytosolique de CaMPARI avant la photoconversion et la stimulation optique optogénique.

Aucune fluorescence rouge n’a été détectée dans des conditions de base, confirmant l’absence de photoconversion avant la stimulation. L’exposition simultanée à la photoconversion à la lumière et la stimulation optogénétique ont entraîné la photoconversion de CaMPARI de fluorescence verte à rouge. L’absence de fluorescence rouge dans le contrôle indique que la photoconversion a été spécifiquement stimulée par une activité neuronale médiée par csChrimson.

La fluorescence delta rouge par vert était significativement plus élevée chez les animaux d’expérimentation que dans aucun contrôle ATR. Ce protocole peut être utilisé pour confirmer le partenariat synaptique en permettant le suivi de la stimulation présynaptique suivie de réponses post-synaptiques immédiates chez des animaux vivants en développement. L’étape la plus difficile est qu’une immobilisation correcte de l’animal nécessitera une pression suffisante pour empêcher le mouvement sans nuire à l’animal.

De futures études pourraient permettre de suivre, de former, de renforcer et même d’éliminer les connexions synaptiques entre des populations neuronales spécifiques lors du développement d’un animal.