Caractérisation fonctionnelle des partenaires pré- et postsynaptiques individuels dans le système nerveux central larvaire de Drosophila à l’aide de CaMPARI

Notre recherche se concentre sur l'évaluation de la connectivité synaptique fonctionnelle entre des partenaires nodaux neuronaux définis chez les larves de Drosophila vivantes et disséquées. Les méthodes conventionnelles nécessitent une dissection ou une stimulation physique. Ce protocole utilise l'optogénétique chez des larves intactes, réduisant ainsi les artefacts.

Pour commencer, faites fondre le milieu d'agar de maïs au micro-ondes pendant 8 à 10 secondes sans le porter à ébullition et laissez-le refroidir à température ambiante sans le laisser se solidifier. Avant le refroidissement complet, ajoutez de l'all-trans-rétinal, ou ATR, à une concentration de 0,5 millimolaires pour compléter le milieu pour les mouches qui nécessitent une activation csChrimson. Couvrez complètement les flacons avec du papier aluminium pour éviter l'exposition à la lumière.

Fécondez des femelles vierges portant les gènes CaMPARI et csChrimson avec des mâles portant les gènes GAL4 et LexA dans des flacons en plastique contenant le milieu préparé. Préparez des flacons parallèles sans ATR comme contrôles. Incubez les flacons à 25 degrés Celsius jusqu'à ce que les larves atteignent le stade du troisième âge.

Utilisez un pinceau pour collecter une larve du troisième âge. Rincez la larve dans une plaque microspot à trois puits contenant du PBS 0,1 molaire pour éliminer tout aliment adhérent. Placez une petite quantité de pâte à modeler à chaque coin d'un porte-objets propre de 18 x 18 millimètres.

Placez la larve dans une goutte de PBS sur le porte-objets et laissez-la s'orienter ventre vers le bas. Placez un porte-objets propre sur le porte-objets contenant la larve. Fixez le porte-objets en appliquant de la pâte à modeler aux coins, en utilisant juste assez de pression pour immobiliser la larve sans l'écraser ou casser le verre.

Placez le porte-objets contenant la larve sur la scène d'un microscope confocal équipé d'un objectif 40x/1,2. Dans l'interface logicielle du microscope, cliquez sur Live. Puis sous le panneau Z Stack, cliquez sur Set First puis Set Last suivi de Stop pour acquérir une Z Stack de base des neurones postsynaptiques, exprimant CaMPARI.

Sous le menu Canaux, réglez le canal vert 488 nanomètres avec une puissance laser de 0,8%. Ensuite, réglez le canal rouge 561 nanomètres à 0,8% de puissance laser. Sous le menu Z Stack, réglez la valeur d'Interval à 1 micromètre.

Dans le menu Acquisition, choisissez Presets pour définir la résolution de 256 x 256 pixels. Une valeur d'Averaging de ligne de 2, un balayage bidirectionnel et une vitesse de balayage de 9, permettant une mise à jour automatique du temps de pixel. Effectuez toutes les images dans un environnement sombre, en maintenant des paramètres d'acquisition identiques tout au long de l'expérience.

Réglez la lumière de photoconversion 405 nanomètres à 0,5% de puissance laser. Et la lumière de stimulation optogénétique 561 nanomètres à 0,8% de puissance laser. Cliquez sur Live, puis sélectionnez Best Fit sous le panneau Histogramme.

Laissez les deux lasers stimuler simultanément la larve pendant 30 secondes, puis arrêtez la stimulation. Pendant l'acquisition post-stimulation ZStack en utilisant les mêmes paramètres que la ligne de base, observez la fluorescence rouge CaMPARI dans les neurones stimulés par laser des larves nourries à l'ATR avec une photoconversion minimale et des contrôles. Dans le logiciel Fiji ImageJ, cliquez sur Fichier, puis choisissez Ouvrir.

Dans la fenêtre d'options d'importation BioFormats avec les paramètres par défaut, cliquez sur OK pour ouvrir l'image ZStack acquise. Sous le menu Image, choisissez Couleur puis Diviser les canaux pour visualiser les canaux rouge et vert de l'image acquise. Pour la soustraction du fond, cliquez sur Processus, puis sélectionnez Soustraire le fond.

Dans la fenêtre contextuelle, réglez le rayon de la boule roulante à 50 pixels puis cliquez sur OK et sélectionnez Oui dans la fenêtre Process Stack. Ensuite, sous le menu Analyser, sélectionnez Outils, puis choisissez ROI Manager pour ouvrir la fenêtre ROI. Utilisez l'outil de sélection libre pour délimiter les zones d'intérêt autour des cellules individuelles.

Dans la fenêtre ROI, sélectionnez Ajouter pour enregistrer le contour sélectionné. Cliquez ensuite sur Mesurer pour générer les résultats de surface, de moyenne, d'écart-type et de densité intégrée. Répétez le processus pour plusieurs cellules du même larve séparément sur les canaux vert et rouge.

Après avoir exporté les résultats dans un tableur, mesurez le rapport rouge sur vert ou R par G des densités intégrées pour chaque cellule, et moyennez ces valeurs pour calculer le rapport moyen R par G par larve pour les images pré et post-stimulation. Enfin, calculez le changement de fluorescence ou le delta R par G en soustrayant le rapport R par G pré-stimulation du rapport R par G post-stimulation pour quantifier l'activité calcique postsynaptique. Les études de connectivité fonctionnelle entre les arborisations dendritiques de classe IV ou les neurones cIVda et les interneurones du bassin-4 chez les larves du troisième âge ont montré que les interneurones du bassin-4 affichaient une fluorescence verte due à l'expression cytosolique de CaMPARI avant la photoconversion et la stimulation lumineuse optogénétique.

Aucune fluorescence rouge n'a été détectée dans des conditions de base, confirmant l'absence de photoconversion avant la stimulation. L'exposition simultanée à la lumière de photoconversion et à la stimulation optogénétique a entraîné une photoconversion de CaMPARI de la fluorescence verte à rouge. L'absence de fluorescence rouge dans le contrôle indique que la photoconversion était spécifiquement entraînée par l'activité neuronale médiée par csChrimson.

Le delta de fluorescence rouge par vert était significativement plus élevé chez les animaux expérimentaux que chez les contrôles sans ATR. Ce protocole peut être utilisé pour confirmer le partenariat synaptique en permettant le suivi de la stimulation présynaptique suivie de réponses postsynaptiques immédiates chez les animaux en développement vivant. L'étape la plus difficile est l'immobilisation appropriée des animaux, qui nécessitera une pression suffisante pour éviter tout mouvement sans nuire à l'animal.

Des études futures pourraient permettre de suivre, la formation, le renforcement et même l'élimination des connexions synaptiques entre des populations neuronales spécifiques au cours du développement d'un animal.