Logiciel de cartographie des paramètres microgliales (MMPS) : un outil open source et convivial pour l’analyse quantitative de la morphologie de la microglie

Le logiciel de cartographie des paramètres microgliaux, ou MMPS, nous permet d’étudier comment la ferroptose modifie les sous-populations microgliales après un AVC ischémique. MMPS répond aux principaux goulots d’étranglement dans le domaine de l’analyse microgliale, contournant les exigences logicielles lourdes et les connaissances requises en codage. Pour commencer, ouvrez le dépôt GitHub sur l’ordinateur et téléchargez le logiciel de mapping Microglial Parameters ou le paquet autonome MMPS.

Dans le dossier des téléchargements, double-cliquez pour lancer l’utilitaire d’archive afin d’extraire automatiquement le dossier compressé. Double-cliquez sur l’icône extraite de l’application MMPS pour vérifier et ouvrir le package MMPS. Cliquez sur sélectionner l’option du dossier image et naviguez dans le répertoire de l’ordinateur pour localiser les fichiers du projet.

Accordez les permissions d’accès aux dossiers et choisissez le répertoire de stockage d’images. Ensuite, cliquez sur sélectionner le dossier de sortie, puis sélectionnez le dossier de sortie. Sélectionnez l’image à traiter, puis choisissez l’étiquetage de l’image.

Attribuez des identifiants animaux et des groupes de traitement à l’image et enregistrez les entrées. Pour calculer la taille des pixels de l’image, sélectionnez calibrer dans la barre d’échelle. Sélectionnez les points de début et de fin de la barre d’échelle, entrez la distance connue de la barre d’échelle en micromètres et cliquez sur appliquer.

Sélectionnez le canal de fluorescence contenant le signal microglial. Sélectionnez les images pour le traitement en cochant la case à côté de chaque nom d’image, et traitez-les individuellement si la fluorescence de fond diffère entre les images. Consultez les onglets original, aperçu, traité et masques pour comparer les étapes de traitement d’image.

Sélectionnez l’aperçu de l’image actuelle pour ajuster des paramètres de traitement supplémentaires. Pour la soustraction de fond, réglez la valeur de la boule roulante entre cinq et 150 pixels. Pour réduire les artefacts d’illumination, utilisez une valeur de réduction du bruit de trois, et réglez les valeurs de netteté entre un et deux pour améliorer la définition des contours.

Après optimisation des paramètres de traitement d’image, cliquez sur les images sélectionnées par le processus. Ensuite, sélectionnez choisir somas, toutes les images. Cliquez sur afficher couleur C pour la vue composite RVB.

Sélectionnez les canaux, puis désélectionnez les canaux inutilisés si l’image apparaît déformée en couleur. Cliquez sur ajustements d’affichage pour ajuster la luminosité du canal dans la vue RGB. Sélectionnez des microglies somas présentant DAPI et une molécule adaptatrice de liaison calcique ionisée un, ou la colocalisation IBA1.

Supprimez le soma mal sélectionné en utilisant la touche retour arrière ou supprimer. Appuyez sur Entrée ou Retour pour passer à l’image suivante. Sélectionnez le plan des somas une fois la sélection du SOMA terminée.

Décrivez le périmètre soma de chaque cellule microgliale sélectionnée avec au moins huit points de contour, en excluant les processus cellulaires. Retirez les points de contour mal placés en annulant le dernier point, en supprimant ou en rétroactivant. Appuyez sur Entrée, Retour, double-clic ou clic droit pour finaliser chaque plan de Soma.

Cliquez sur générer tous les masques après avoir terminé le plan Soma. Dans les paramètres de génération de masques, ajustez l’intensité minimale pour réduire les pixels de fond et équilibrer la suppression de fond et la préservation des branches. Sélectionnez QA de tous les masques pour commencer l’assurance qualité des masques, et examinez tous les masques présentés, des plus grands aux plus petits.

Comparez chaque masque à la microglie correspondante en utilisant les onglets de traitement et de masque. Pour accepter les masques, utilisez le raccourci clavier A. Pour rejeter les masques, utilisez le raccourci clavier R.

Pour annuler une acceptation ou un refus, appuyez sur B. Utilisez les touches flèches du clavier pour naviguer entre les tailles de masques. Sélectionnez le plus grand masque acceptable qui capture avec précision la branche microgliale sans inclure les cellules voisines, l’excès de fond, les bordures d’image ou les barres d’échelle. Si la plupart sont inexactes, utilisez l’option de réinitialisation des masques pour régénérer les masques avec une valeur seuil différente.

Ensuite, sélectionnez calculer des caractéristiques simples pour calculer différents paramètres des masques acceptés, puis cliquez sur ok. Pour une analyse complémentaire, téléchargez fractalanalysisimagej. Py, sholl.

py, et squeletteanalysimagej. Plugins PY. Pour les analyses fractales et de coque, ouvrez et exécutez l’image fractal.

py en tant que plugin Fiji. Ensuite, saisissez l’emplacement du répertoire de sortie. Saisissez la taille du pixel et sélectionnez la plus grande option masque uniquement pour analyser le plus grand masque accepté par cellule.

Pour l’analyse du sholl, ouvrez le sholl. py en tant que plugin Fiji. Saisissez l’emplacement du répertoire de sortie, la taille du pixel désiré, la taille du pas.

Sélectionnez utiliser le rayon Soma comme rayon de départ, ou entrer une valeur fixe de rayon Soma si les rayons soma dérivés du MMPS ne sont pas utilisés. Analyse squelettique ouverte imagej. py comme plugin fidjien pour l’analyse de squelettes.

Parcourez et entrez les chemins du répertoire masques, du répertoire de sortie et de la taille des pixels lorsque vous le demandez. Une fois terminé, exportez tous les résultats générés par le plugin sous forme de fichiers de valeurs séparées par virgules dans les répertoires de sortie spécifiques. L’étude de validation de MMPS utilisant un modèle de neuroinflammation rongeur induit par lipopolysaccharide ou LPS a montré que l’administration de LPS diminuait significativement la distance moyenne du centroïde et le périmètre cellulaire par rapport aux témoins traités par véhicule.

Aucune différence significative n’a été observée dans la zone du masque, la rondeur ou l’excentricité entre les groupes traités. La zone de soma a été significativement augmentée chez les animaux traités par LPS par rapport aux témoins en véhicule, compatibles avec un remodelage morphologique associé à l’activation des cellules gliales. Plus en aval, des analyses morphologiques avancées ont montré qu’une faible corrélation entre la rondeur et le périmètre de la microglie chez les rats traités par véhicule, et une forte corrélation chez les rats traités par LPS, suggérant l’association entre une activation microgliale accrue et une réduction de la rondeur et du périmètre.

De plus, la zone du masque a montré de fortes corrélations positives avec la distance moyenne du centroïde chez les groupes véhiculaires et traités par LPS, compatibles avec des changements de branchement liés à l’activation microgliale. Ce protocole permet aux chercheurs d’étudier les branches microgliales complexes, l’homogénéité morphologique et la complexité structurelle. Obtenir des images immunofluorescentes à haute résolution est essentiel pour utiliser avec précision le MMPS.

De futures études pourront utiliser la MMPS pour étudier comment les inhibiteurs ferroptotiques modifient la morphologie microgliale après différentes maladies du système nerveux telles que l’AVC.