Logiciel de cartographie des paramètres microgliales (MMPS) : un outil open source et convivial pour l’analyse quantitative de la morphologie de la microglie

Le logiciel de cartographie des paramètres microgliaux, ou MMPS, nous permet d'étudier comment la ferroptose modifie les sous-populations microgliales après un accident vasculaire cérébral ischémique. MMPS répond aux principaux goulots d'étranglement dans le domaine de l'analyse microgliale, en contournant des exigences logicielles fastidieuses et des connaissances en codage requises. Pour commencer, ouvrez le dépôt GitHub sur l'ordinateur et téléchargez le package autonome Mapping Microglial Parameters Software ou MMPS.

Dans le dossier des téléchargements, double-cliquez pour lancer l'utilitaire d'archive afin d'extraire automatiquement le dossier compressé. Double-cliquez sur l'icône de l'application MMPS extraite pour vérifier et ouvrir le package MMPS. Cliquez sur l'option de sélection du dossier d'images et naviguez dans le répertoire de l'ordinateur pour localiser les fichiers du projet.

Accordez les autorisations d'accès au dossier et choisissez le répertoire de stockage des images. Ensuite, cliquez sur sélectionner le dossier de sortie, puis choisissez le répertoire de sortie. Sélectionnez l'image à traiter, puis choisissez l'étiquetage des images.

Attribuez des identifiants d'animaux et des groupes de traitement à l'image et enregistrez les entrées. Pour calculer la taille des pixels de l'image, sélectionnez calibrer à partir de la barre d'échelle. Sélectionnez les points de début et de fin de la barre d'échelle, et entrez la distance connue de la barre d'échelle en micromètres, puis cliquez sur appliquer.

Sélectionnez le canal de fluorescence contenant le signal microglial. Sélectionnez les images à traiter en cochant la case à côté de chaque nom d'image, et traitez-les individuellement si la fluorescence de fond diffère entre les images. Examinez les onglets original, aperçu, traité et masques pour comparer les étapes de traitement d'image.

Sélectionnez l'aperçu de l'image actuelle pour ajuster les paramètres de traitement supplémentaires. Pour la soustraction du fond, réglez la valeur du ballon roulant entre cinq et 150 pixels. Pour réduire les artefacts d'illumination, utilisez une valeur de débruitage de trois, et réglez les valeurs d'aiguisage entre un et deux pour améliorer la définition des bords.

Après l'optimisation des paramètres de traitement d'image, cliquez sur traiter les images sélectionnées. Ensuite, sélectionnez choisir les somas, toutes les images. Cliquez sur montrer la couleur C pour la vue composite RGB.

Sélectionnez les canaux, puis désélectionnez les canaux inutilisés si l'image apparaît déformée en couleur. Cliquez sur ajustements d'affichage pour ajuster la luminosité des canaux dans la vue RGB. Sélectionnez les somas microgliaux affichant DAPI et l'adaptateur de liaison du calcium ionisé un, ou la colocalisation IBA1.

Supprimez le soma mal sélectionné en utilisant la touche de suppression ou la touche de suppression arrière. Appuyez sur entrer ou retour pour passer à l'image suivante. Sélectionnez contourner les somas après que la sélection des somas soit terminée.

Délimitez le périmètre des somas de chaque cellule microgliale sélectionnée avec au moins huit points de contour, en excluant les processus cellulaires. Supprimez les points de contour mal placés en utilisant annuler le dernier point, supprimer ou supprimer arrière. Appuyez sur entrer, retour, double-cliquez ou cliquez droit pour finaliser chaque contour de soma.

Cliquez sur générer tous les masques après avoir terminé le contournement des somas. Dans les paramètres de génération de masques, ajustez l'intensité minimale pour réduire les pixels de fond et équilibrer la suppression du fond et la préservation des branches. Sélectionnez QA tous les masques pour commencer l'assurance qualité des masques, et examinez tous les masques présentés du plus grand au plus petit domaine.

Comparez chaque masque au microglia correspondant en utilisant les onglets traité et masque. Pour accepter les masques, utilisez le raccourci clavier A. Pour rejeter les masques, utilisez le raccourci clavier R.

Pour annuler une acceptation ou un rejet, appuyez sur B.Utilisez les touches fléchées du clavier pour naviguer entre les tailles de masque. Sélectionnez le plus grand masque acceptable qui capture avec précision la ramification microgliale sans inclure les cellules voisines, le fond excessif, les bords de l'image ou les barres d'échelle. Si la plupart sont inexactes, utilisez l'option effacer tous les masques pour régénérer les masques avec une valeur de seuil différente.

Ensuite, sélectionnez calculer les caractéristiques simples pour calculer divers paramètres pour les masques acceptés, puis cliquez sur ok. Pour une analyse supplémentaire, téléchargez fractalanalysisimagej. py, sholl.

py, et les plugins skeletonanalysisimagej. py. Pour les analyses fractales et de coque, ouvrez et exécutez fractalanalysisimagej.

py en tant que plugin Fiji. Ensuite, entrez l'emplacement du répertoire de sortie. Entrez la taille des pixels et sélectionnez l'option le plus grand masque uniquement pour analyser le plus grand masque accepté par cellule.

Pour l'analyse Sholl, ouvrez sholl. py en tant que plugin Fiji. Entrez l'emplacement du répertoire de sortie, la taille de pixel souhaitée, la taille de pas.

Sélectionnez utiliser le rayon du soma comme rayon de départ, ou entrez une valeur de rayon du soma fixe si les rayons du soma dérivés de MMPS ne sont pas utilisés. Ouvrez skeletonanalysisimagej. py en tant que plugin Fiji pour l'analyse de squelette.

Parcourez et entrez les chemins pour le répertoire de masques, le répertoire de sortie et la taille des pixels lorsqu'il est demandé. À la fin, exportez tous les résultats générés par le plugin en tant que fichiers séparés par des virgules dans les répertoires de sortie spécifiques. L'étude de validation de MMPS utilisant un modèle de neuroinflammation chez les rongeurs induite par des lipopolysaccharides ou LPS a montré que l'administration de LPS diminuait significativement la distance moyenne des centroids et le périmètre cellulaire par rapport aux contrôles traités par véhicule.

Aucune différence significative n'a été observée dans la zone du masque, la rondeur ou l'excentricité entre les groupes de traitement. La zone du soma était significativement augmentée chez les animaux traités par LPS par rapport aux contrôles par véhicule, conformément au remodelage morphologique associé à l'activation des cellules gliales. Plus en aval, des analyses morphologiques avancées ont démontré une faible corrélation entre la rondeur et le périmètre des microglia dans les rats traités par véhicule, et une forte corrélation chez les rats traités par LPS, suggérant l'association d'une activation microgliale accrue avec une diminution de la rondeur et du périmètre.

De plus, la zone du masque a démontré de fortes corrélations positives avec la distance moyenne des centroids dans les groupes véhicule et LPS traités, conformément aux changements de ramification liés à l'activation microgliale. Ce protocole permet aux chercheurs d'étudier la ramification microgliale complexe, l'homogénéité morphologique et la complexité structurelle. Obtenir des images immunofluorescentes de haute résolution est essentiel pour utiliser MMPS avec précision.

Les études futures peuvent utiliser MMPS pour étudier comment les inhibiteurs de ferroptose modifient la morphologie microgliale après différentes maladies du système nerveux telles que l'accident vasculaire cérébral.