Construction et implantation d'un système de livraison microperfusion soutenue des agents neuroactifs.

Bonjour, je m'appelle Miles Cunningham. Avec Ryan O'Connor et Sydney Wong, nous allons démontrer la construction d'un système de micro-infusion pour l'administration continue d'agents neuroactifs. Ce travail a été réalisé au laboratoire de neuro-reconstruction de l'hôpital McLean, de l'école de médecine de Harvard.

Nous tenons à remercier la fondation Sydney rbe et Narsad pour leur soutien généreux. Nous avons constaté que les agents neuroactifs peuvent être délivrés de manière fiable à des sites cérébraux spécifiques à l’aide d’une microcanule en verre de borosilicate étirée, dont le diamètre de l’extrémité est cinq à dix fois plus petit que celui des canules de délivrance conventionnelles. Sur cette diapositive, nous présentons une canule d’infusion en acier inoxydable couramment utilisée à côté d’une microcanule que nous avons fabriquée dans ce laboratoire.

Cette réduction de la taille de la canule d'administration se traduit par une diminution spectaculaire du traumatisme subi par la région cérébrale étudiée. De nombreuses méthodes conventionnelles produisent en effet une lésion dans ou au voisinage de la zone d'intérêt, ce qui remet en question la validité de tout résultat obtenu. Vous pouvez observer ici, dans le panneau A, l'importance de la perturbation de la zone locale causée par une canule de 0,32 millimètre, comparée à celle d'une canule de 50 microns dans le panneau B. Ces photos prises en faible grossissement représentent des montages humides de sections Vibram non colorées.

Ces mêmes sections ont ensuite été colorées à l’hématoxyline et à l’éosine et observées à un grossissement plus élevé. Afin d'illustrer davantage la réduction des lésions tissulaires avec la microcannule, les composants du système de microinfusion sont une pompe mini-osmotique Zet équipée de son modulateur de débit en acier inoxydable dont la collerette a été retirée. Deux à trois centimètres de tubulure en polyéthylène, une microcannule en silicate de bore d'alumine (BOA) sur mesure, et un fil-guide de calibre 28 ; ceci constitue le système de microinfusion assemblé, prêt à être implanté.

Une polariseuse verticale standard est utilisée ici pour créer des microcannules aux spécifications souhaitées. Les polariseuses horizontales conviennent également. Le tube en borosilicate est positionné et fixé en faisant varier la température de l'élément chauffant et la tension de la polariseuse.

Vous pouvez reproduire de manière fiable des microcannules avec des diamètres spécifiques et des tiges effilées longues. Le tube en silice Bora est chauffé et une pression douce est appliquée pour réduire le tube d'une quantité de courbure souhaitée. Cette courbure est réalisée à une distance de l'extrémité de la microcannule adaptée à la profondeur de la cible cérébrale d'intérêt et permettant un dégagement au-dessus du crâne.

La longueur finale de ce tube distal de microcannule, le coude, est d’environ neuf à dix millimètres. Manifestement insatisfait de son résultat, Ryan réinsère la microcannule afin d’effectuer un réglage fin et parfaire l’angle du coude.

C'est nettement meilleur en utilisant un crayon à pointe de diamant. Sydney démontre une méthode pour couper le tube en silicate de bore à environ cinq millimètres en proximal du coude, en tenant fermement le tube sur une surface dure, la partie distale de la microcannule étant libre de dépasser du bord. Elle incise le tube de manière circulaire.

Ensuite, en appliquant une pression douce, elle casse proprement le tube au niveau de l'interface marquée. L'extrémité fine et transparente de la canule peut alors être colorée avec une encre permanente afin de faciliter sa visualisation. Pendant l'intervention chirurgicale sous microscope, l'extrémité de la microcanule est coupée avec des ciseaux de microdissection afin d'obtenir le diamètre souhaité.

Le diamètre de la pointe peut être vérifié à l’aide d’un oculaire ou d’un microscope. Les fils d’alignement radical sont préparés à partir de fil d’acier inoxydable de calibre 28, découpé en morceaux d’environ trois centimètres de longueur. Des pinces sont ensuite utilisées pour former un petit crochet à l’extrémité de chaque fil, d’environ deux millimètres de diamètre.

Les fils d'alignement sont placés dans une boîte de Pétri avec des morceaux de deux à trois centimètres de tubulure en polyéthylène insérés dans les microcannules. Le système de microinfusion peut être assemblé à l'aide d'instruments couramment présents dans la plupart des laboratoires. Des micro-pinces, des pinces classiques, des ciseaux chirurgicaux et des hémostats sont disposés sur un champ opératoire pour stérilisation.

Les instruments, les composants du système de microinfusion, ainsi que plusieurs feuilles de papier d'aluminium sont stérilisés à l'aide d'un autoclave standard. Le modulateur de flux est soigneusement retiré de son emballage et placé dans une boîte de Pétri stérile. Il est maintenu fermement avec des pinces hémostatiques et la bride en plastique est retirée du tube modulateur en acier inoxydable à l'aide de ciseaux.

La pompe osmotique miniature est également retirée de son emballage et placée dans une boîte de Pétri stérile. Le tube en acier inoxydable est inséré dans le tube en polyéthylène sur une longueur de deux à trois millimètres, puis les deux sont scellés ensemble à l’aide d’un époxyde activé par la lumière. Nous utilisons du Lummi bond provenant de mon laboratoire neural pour les travaux délicats ; nous chargeons une seringue d’un cc avec du Lummi bond et utilisons une aiguille de calibre 27 comme applicateur. Sous une lumière intense, le Lumon durcit en quelques secondes.

La pompe osmotique miniature est remplie en la tenant en position verticale et en injectant soigneusement le liquide à l’aide de l’aiguille de remplissage fournie par le fabricant. Nous recommandons d’observer le volume de liquide injecté dans la pompe ou de peser la pompe avant et après le remplissage afin de s’assurer qu’elle est complètement remplie et qu’elle n’est pas défectueuse. Notez que nous ne recommandons pas de réutiliser les pompes.

Le modulateur complet, avec son tube en polyéthylène, est ensuite inséré dans la mini pompe osmotique. Le liquide contenu dans la pompe sera forcé dans le tube en polyéthylène au fur et à mesure que le modulateur en mousse est inséré. La distance initiale du tube en polyéthylène rempli de liquide est notée et devrait être observée en augmentation après activation de la pompe par incubation avec du sérum physiologique stérile à 39 degrés Celsius, après 12 heures d'incubation.

La pompe osmotique miniaturisée activée est immergée dans une solution saline stérile, ce qui fournit un environnement sans air pour les étapes finales de la construction du système de microinfusion. Une seringue équipée d'un petit tube en plastique et remplie de la même solution contenue dans la pompe est utilisée pour déplacer l'air de la partie non remplie du tube en polyéthylène. Remarquez que l'air présent dans la microcannule doit être évacué.

De même, l'extrémité distale du tube en polyéthylène peut nécessiter un léger élargissement à l'aide de micro-forceps, puis l'extrémité proximale de la micro-cannule est insérée. L'ensemble du système est désormais exempt d'air ou d'espace mort et peut être retiré du bain salin, puis séché avec un matériau stérile. Le Luma bond est ensuite appliqué pour fixer la micro-cannule au tube en polyéthylène. Pour réduire d'environ moitié le débit de la mini pompe osmotique, du paraffine stérile chauffée est versée dans une petite boîte de Pétri, et la moitié proximale de la mini pompe osmotique y est brièvement immergée.

L'excès de paraffine est absorbé et le système de microinfusion est replacé dans du sérum physiologique stérile et conservé jusqu'à la chirurgie. Juste avant l'implantation chirurgicale, le fil-guide est fixé à la courbure de la microcannule.

L'axe longitudinal du fil-guide est aligné avec la partie de la microcannule qui pénétrera dans le tissu cérébral et est fixé avec du lumon. Dans cette position, le système de microinfusion peut ensuite être positionné sur un manipulateur d'instrument stéréotaxique.

Le fil-guide est fixé à l'aide d'une pince de bras manipulateur, et la pompe est suspendue depuis le haut à l'aide d'une boucle de fil stérile. Cela permettra de supporter son poids et d'aligner parfaitement la microcannule perpendiculairement à la surface du crâne en courbant soigneusement le fil-guide avec une pince, puis le système de microinfusion peut être implanté selon une procédure stéréotaxique classique. Le tube en boël est fixé à la surface du crâne à l'aide d'un adhésif.

Nous utilisons le matériau Jaron pour façonner un socle de faible hauteur. Le fil-guide excédentaire dépassant au-dessus de la préparation est ensuite coupé au ras de la surface du socle. À l’aide d’un disque de coupe fixé à une perceuse à grande vitesse, la mini pompe osmotique peut ensuite être placée sous-cutanément entre les omoplates de l’animal.

La méthode actuelle présente plusieurs avantages par rapport aux techniques traditionnelles. Elle peut être personnalisée en fonction de l'espèce et de l'âge de l'animal expérimental. Le tube en silice peut être façonné pour épouser la surface du crâne de l'animal.

Par conséquent, en permettant une fixation sécurisée au profil bas et en éliminant la nécessité d'un large socle crânien, la plaie chirurgicale peut facilement être refermée au-dessus du socle de microinfusion profilé, réduisant ainsi le risque d'infection ainsi que le malaise pour l'animal, et la fixation du système au crâne nécessite une moindre surface. Ainsi, des procédures supplémentaires ou ultérieures peuvent être réalisées sans interférence d'un socle plus encombrant. Mais surtout, cette méthode réduit l'invasivité et le traumatisme au niveau de l'environnement local du site d'infusion, minimisant par conséquent l'effet observateur.

Ce sont les changements que l'observation active entraînera sur le phénomène observé.