Name: Essais de co-culture sans contact pour les études morphométriques lors dinteractions interspécifiques chez les champignons (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-08-28T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Découvrez deux méthodes de co-culture sans contact pour étudier les interactions interspécifiques chez les champignons. Ces protocoles permettent d'analyser les réponses morphologiques et les communications microbiennes par diffusion moléculaire.

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Les auteurs déclarent ne pas avoir d'intérêts concurrents ou conflictuels.

Un rapport antérieur, utilisant une plaque de puits avec inserts de membrane et un dosage basé sur le surnageant de culture filtré (CFS), a montré que C. albicans développe des hyphes en réponse à des cellules de C. glabrata ou à leur CFS. Toutefois, cette réponse n'était pas induite par d'autres levures, telles que Saccharomyces cerevisiae et Candida dubliniensis30. De plus, cette réponse hyphale n'était pas limitée à la souche de référence en laboratoire C. albicans SC5314, mais se produisait également dans d'autres contextes génomiques, notamment l'isolat clinique WUM5A30. Dans ce protocole, un flux de travail standardisé a été établi à partir de ces résultats afin de quantifier trois paramètres morphologiques : la longueur des hyphes, le volume des hyphes et l'épaisseur des hyphes. En outre, ces facteurs morphologiques ont été utilisés pour évaluer comment les variations de ploïdie et l'état du locus de type de conjugaison influencent les caractéristiques morphologiques de C. albicans en réponse à une molécule inductrice sécrétée.
Les méthodologies sans contact décrites ici offrent un cadre expérimental simple pour visualiser et analyser les résultats morphométriques des signaux solubles inter-espèces. Alors que la plaque de culture avec inserts à membrane permet une diffusion bidirectionnelle entre les cultures actives, le test basé sur le surnageant de culture filtré (CFS) propose un format évolutif, car les composants inducteurs requis sont collectés indépendamment de la culture cible en aval. Le maintien d’un ratio d’environ 1:50 (C. albicans par rapport à C. glabrata) dans le montage avec plaque d’inserts à membrane est nécessaire pour assurer la reproductibilité du test. Ce gradient de concentration garantit un flux adéquat de molécules inductrices solubles à travers la barrière membranaire, tout en restant en dessous des seuils d’accumulation des inhibiteurs endogènes de type quorum sensing, tels que le farnésol, qui peuvent supprimer la cinétique de filamentation de C. albicans31,32. De même, une étape cruciale du test basé sur le CFS est la période d’incubation de 18 h nécessaire pour que la culture source de C. glabrata atteigne uniformément la phase stationnaire tardive. Si la durée d’incubation de la culture de C. glabrata est inférieure à 12 h ou supérieure à 24 h, le CFS recueilli aura probablement une concentration sous-optimale de la molécule inductrice spécifique étudiée ici, ce qui entraînera une induction hyphale sous-optimale. Le stade de croissance approprié pour la collecte du CFS ou le ratio des cultures doit être standardisé pour tout nouvel objectif expérimental et/ou toute nouvelle combinaison d’espèces microbiennes.
Pour maximiser la reproductibilité du test dans différents environnements de laboratoire, les améliorations procédurales clés suivantes sont recommandées. Il est recommandé d'utiliser un milieu minimal au glucose (GMM) pour la culture nocturne de toutes les souches diploïdes de C. albicans. L'utilisation du GMM supprime l'auto-filamentation de fond fréquemment observée dans le milieu riche en nutriments YPD. Cette auto-filamentation a également été observée dans d'autres études, bien que le mécanisme sous-jacent reste encore mal compris33. Il est également recommandé de retirer physiquement intégralement l'insert en membrane de polycarbonate avant l'acquisition des images afin d'éliminer la diffusion de la lumière et les aberrations optiques pouvant interférer lors de la microscopie en champ clair à fort grossissement.
Bien que ces configurations sans contact permettent de distinguer les rôles des composants solubles du signal, elles présentent des défis expérimentaux spécifiques. Par exemple, les tests sans contact sont sujets à de légers risques tels que la rupture de la membrane due à une manipulation inadéquate, entraînant ainsi un passage microbien. Il convient donc d’être attentif lors du positionnement des pointes de pipette, en veillant à ce qu’elles touchent les parois de la chambre des inserts et non la membrane, lors de l’échantillonnage. De plus, une contamination croisée physique peut également survenir entre les compartiments en raison de tailles de pores inappropriées (trop grandes), ce qui peut être facilement corrigé en utilisant des inserts dotés d’une taille de pore de membrane adaptée. Une surcroissance fongique ou un dépôt important de biofilm peut recouvrir la membrane poreuse. Ce problème est résolu en limitant les inoculations initiales à une DO600 = 0,1 et en n’incubant pas au-delà de 12 heures. En outre, les micro-organismes peuvent ne pas se répartir de manière homogène dans les puits du dispositif, s’agglutinant souvent ou s’attachant près de la membrane, ce qui peut entraîner des biais inattendus dans les mesures de densité optique. En outre, comme ces systèmes séparent physiquement les deux populations, ils ne peuvent ni reproduire ni évaluer les interactions dépendant d’un contact cellulaire direct. Par exemple, la maturation de biofilms mixtes, la coagrégation mécanique ou la signalisation induite par des adhésines pariétales ancrées à la surface. Bien que ces tests sur plaque fournissent une vue d’ensemble efficace du stade initial de la cinétique de filamentation (à 3 h), ils ne rendent pas compte de la dynamique de croissance à long terme ni du comportement spatial. Pour les chercheurs nécessitant un suivi en continu et en temps réel sur des périodes prolongées, des canaux de perfusion microfluidiques spécialisés ou des chambres d’imagerie automatisées pour cellules vivantes peuvent constituer une alternative plus adaptée.
La géométrie cellulaire est fondamentalement liée à l'efficacité métabolique, le rapport surface sur volume (S/V) étant un facteur clé dans l'acquisition de nutriments et le transport intracellulaire. Chez les champignons dimorphes et filamenteux, la transition vers un morphotype hyphal allongé constitue une adaptation structurelle permettant de maintenir un rapport S/V optimal. Cela permet une absorption distribuée des nutriments le long de la paroi allongée du filament tout en maintenant des processus métaboliques dirigés vers l'extrémité hyphale34,35,36,37. Toutefois, notre étude montre que la mise à l'échelle morphométrique n'est pas uniformément proportionnelle selon les états de ploïdie et les configurations du locus de type sexuel.
Les jeux de données morphométriques générés via ce protocole de suivi révèlent des tendances claires de mise à l'échelle structurelle corrélées à la ploïdie, les lignées haploïdes présentant systématiquement des valeurs absolues plus faibles pour toutes les métriques géométriques par rapport aux souches diploïdes correspondantes (Figure 5). Dans le contexte diploïde, la configuration homozygote MATα/α a montré une cinétique de filamentation accrue (longueur et volume) par rapport aux souches MATa/a ou MATa/α dans ces conditions in vitro. Étant donné qu'une filamentation accrue est fréquemment associée à une capacité de pénétration plus élevée, on ne comprend pas clairement pourquoi les isolats cliniques de C. albicans sont principalement obtenus sous forme de diploïdes hétérozygotes (MATa/α). Il est possible que, dans un hôte immunocompétent, l'état hétérozygote confère un avantage de fitness plus étendu pour une colonisation commensale à long terme. Autrement dit, les caractéristiques structurelles du morphotype MATa/α sont optimisées pour la survie face à la surveillance immunitaire de l'hôte. Par conséquent, les futures recherches devraient exploiter ces systèmes de co-culture standardisés afin d'évaluer systématiquement le fitness comparatif des différents homozygotes de type d'accouplement sous différentes pressions sélectives.
Des études antérieures ont montré que la morphologie vacuolaire, les dynamiques de fission-fusion et l'expansion structurelle jouent un rôle important dans la régulation du volume interne et de la pression de turgescence des filaments fongiques en allongement. Par exemple, chez l'agent pathogène du blast du riz Magnaporthe oryzae, les transitions distinctes entre des hyphes végétatifs filiformes et des structures invasives bulbiformes sont étroitement coordonnées avec des modifications de l'organisation vacuolaire38,39,40. Toutefois, le protocole actuel n’a pas permis de suivre directement les dynamiques vacuolaires pendant la filamentation de C. albicans ; l’analyse de ces modifications des organites internes en relation avec le volume structural total représente une piste informative pour de futures recherches. En outre, des études supplémentaires sont nécessaires afin de déterminer pourquoi certains composants spécifiques du sécrétome d'origine fongique induisent des cinétiques d'échelle morphologique différentes de celles provoquées par des inducteurs chimiques d'origine hôte, tels que le sérum.
Les méthodes de co-culture sans contact décrites dans ce protocole peuvent être adaptées pour étudier les interactions inter-espèces et transversales aux royaumes, telles que la dynamique de signalisation entre des populations bactériennes opportunistes et des champignons dimorphes. De plus, comme ces formats en plaques de 96 et 24 puits sont évolutifs, cette plateforme quantitative peut être utilisée pour des criblages chimiques. Parmi eux, on peut citer l'identification d'inhibiteurs de petites molécules ou de nouveaux composés antifongiques capables de perturber sélectivement les voies de filamentation stimulées par le sécrétome, sans affecter directement la viabilité cellulaire de base.

Dans les écosystèmes naturels et cliniques, les micro-organismes résident généralement au sein de communautés polymicrobiennes structurées, régies par des réseaux complexes d'interactions intra- et&#160;inter-espèces&#160;communication1Ces consortiums utilisent divers signaux chimiques, notamment des molécules de type quorum-sensing, des composés organiques volatils, ainsi que des peptides et des protéines sécrétés, afin de coordonner des comportements au niveau des populations.2Cartographier ces dynamiques de communication est essentiel, car les interactions coopératives, compétitives ou prédatrices au sein des niches modifient considérablement le métabolisme microbien, l'architecture spatiale et l'adaptation au stress.3Cliniquement, ces réseaux polymicrobiens (tels que les consortiums bactéro-fongiques à deux espèces ou les consortiums fongo-fongiques interspécifiques) présentent fréquemment une virulence synergique, une colonisation accélérée des tissus et une résistance accrue aux antimicrobiens, par rapport aux monocultures.4,5. La découverte des déterminants moléculaires des communications microbiennes est donc essentielle pour dépasser les modèles traditionnels et développer des stratégies anti-infectieuses innovantes capables de perturber la stabilité des communautés microbiennes6.
Pour disséquer les différents modes de communication microbienne, les chercheurs utilisent des configurations expérimentales variées, principalement employées en biologie cellulaire des mammifères, en immunologie et en oncologie7,8,9. Par exemple, les modèles de co-culture en contact direct constituent la norme pour étudier la signalisation&#160;juxtacrine&#160;et les interactions physiques entre cellules10. Des dispositifs similaires, modifiés, sont également utilisés pour étudier les interactions physiques entre micro-organismes, afin de comprendre l'inhibition croisée entre micro-organismes ou la réponse aux médicaments9,11,12. Toutefois, il est difficile de distinguer les mécanismes sous-jacents, car les signaux dépendants du contact et les signaux diffusibles contribuent tous deux à la réponse observée. Bien que les essais classiques basés sur le contact puissent fournir des informations spatiales, ils sont laborieux et/ou nécessitent un marquage distinct des souches, ce qui peut s'avérer fastidieux pour les organismes non modèles. En revanche, les essais Transwell (plaque de culture avec insert à membrane) sont utilisés, principalement dans les études sur les cellules de mammifères, pour distinguer les contributions des signaux dépendants du contact et des signaux diffusibles13,14,15,16. Cette méthode est particulièrement utile lorsque la communication cellulaire est médiée par des molécules sécrétées, permettant une analyse en temps réel de la dynamique des signaux entre populations cellulaires17. De plus, les essais sans contact offrent l'avantage d'une séparation par membrane, ce qui permet également d'intégrer des expériences avec des modèles informatiques afin de suivre dynamiquement les micro-organismes que les méthodes traditionnelles ne détectent pas18. Cette approche est parfois utilisée pour étudier simultanément la cinétique du développement de différentes espèces bactériennes19.
Une alternative plus économique et à haut débit au test utilisant des plaques de culture avec inserts de membrane est le test fondé sur le surnageant acellulaire (CFS) ou sur un milieu conditionné. Ce dernier est connu pour être utilisé en médecine régénérative et en biologie vasculaire afin d'isoler les sécrétomes nécessaires à la compréhension de la réparation tissulaire médiée par les cellules souches et/ou de l'angiogenèse induite par les tumeurs20. De manière similaire, dans les études microbiennes, les approches fondées sur le CFS se sont révélées utiles pour décrypter la compétition polymicrobienne. Par exemple, des filtrats bactériens (tels que les&#160;Pseudomonas aeruginosa&#160;acyl-homosérines lactones ou les&#160;Lactobacillus&#160;métabolites) ont été utilisés pour moduler la maturation de biofilms fongiques21,22.&#160;Récemment, les plateformes microfluidiques ont permis une biomimétique physiologique de haute fidélité grâce aux technologies d'organes-sur-puce23,24. Bien que des systèmes microfluidiques aient été mis en œuvre pour la détection simultanée de la réponse de la communauté microbienne à leurs sécrétomes, ils nécessitent un équipement spécialisé et une expertise particulière, et ne peuvent pas être facilement mis en place dans tous les contextes25,26,27. Ainsi, les tests utilisant des plaques avec inserts de membrane ou fondés sur le CFS s'annoncent comme les méthodes de choix dans la plupart des cas. Le choix entre ces deux tests dépendra de la nature de la molécule sécrétée. Si la molécule sécrétée est instable, c’est-à-dire qu’elle a une courte demi-vie, et qu’il est nécessaire de mesurer son activité en temps réel, le test utilisant des plaques avec inserts de membrane est plus approprié. En revanche, si la molécule sécrétée est stable et que l’expérience est réalisée à grande échelle, un test fondé sur le CFS sera plus économique.
L'objectif principal de ce protocole est de présenter une méthodologie qualitative et quantitative étape par étape permettant de suivre les caractéristiques morphologiques, en utilisant les plaques de culture avec inserts membranaires et les plates-formes CFS (Figure 1). Ici, cette approche est illustrée par la communication induite par des facteurs sécrétés entre Candida albicans et Candida glabrata. En outre, ces outils permettent également de quantifier les effets de variables génétiques intrinsèques (ploïdie et statut du locus de conjugaison) sur le développement géométrique absolu (longueur, volume et diamètre) des filaments de&#160;C. albicans&#160;lorsqu'ils sont exposés à des molécules de signalisation sécrétoires. Ce protocole établi fournit une plate-forme simple, abordable et sans contact, adaptée à l'étude de la dynamique de signalisation interspécifique.

<table><tbody><tr><td>Filtre à seringue PES de 0,22 &amp;mu;m</td><td>Millipore (Merck)</td><td>SLGPR33RS</td><td></td></tr><tr><td>Agar-agar</td><td>HiMedia</td><td>GRM666</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>HiMedia</td><td>GRM016</td><td></td></tr><tr><td>Plaque porteuse Nunc à 24 puits avec inserts pour culture cellulaire (0,4 &amp;mu;m)</td><td>Thermo Scientific</td><td>141002</td><td></td></tr><tr><td>Boîte multidose Nunc BioLite à 96 puits, traitée pour culture cellulaire, fond plat</td><td>Thermo Scientific</td><td>130188</td><td></td></tr><tr><td>Protéose peptone</td><td>HiMedia</td><td>RM005</td><td></td></tr><tr><td>Uridine</td><td>Sigma</td><td>U6381</td><td></td></tr><tr><td>Extrait de levure</td><td>HiMedia</td><td>RM027</td><td></td></tr><tr><td>Base d'azote de levure, avec sulfate d'ammonium, sans acides aminés</td><td>HiMedia</td><td>M878</td><td></td></tr></tbody></table>

essais de co-culture sans contact pour les études morphométriques lors d'interactions interspécifiques chez les champignons

Contactless Co-Culture Assays for Morphometric Studies During Inter-Species Interactions in Fungi

Le comportement et la morphologie cellulaires sont généralement influencés par divers facteurs intra- et extracellulaires au sein d'une communauté microbienne. Les différentes approches disponibles pour étudier la communication microbienne peuvent être fastidieuses et/ou nécessiter des installations spécialisées ainsi qu'une expertise particulière.&#160;Ici, deux approches complémentaires de co-culture sans contact sont décrites : le test de co-culture en plaque de puits avec insert de membrane et le test basé sur le surnageant cellulaire libre (CFS), qui reposent sur la transition morphologique comme réponse mesurable afin d'explorer le rôle de divers facteurs dans une interaction interspécifique donnée. Le système de plaque de puits avec insert de membrane permet, tout en autorisant la diffusion de molécules extracellulaires, une interaction en temps réel entre des espèces physiquement séparées. En comparaison, le test basé sur le CFS offre une approche simplifiée et reproductible pour évaluer les réponses à des milieux conditionnés. Le protocole présenté ici inclut des procédures standardisées pour la préparation des cultures, la production de surnageants conditionnés, la mise en place du test, la microscopie, l'acquisition d'images, l'analyse morphométrique quantitative à l'aide de Fiji, ainsi que l'évaluation statistique. Cela est illustré par un exemple de réponse morphologique fongique à des facteurs intrinsèques et extrinsèques. Les méthodes décrites ici fournissent des outils accessibles et adaptables pour étudier de nouvelles interactions microbiennes au sein d'une communauté, et pourraient facilement être étendues afin d'explorer les mécanismes sous-jacents à la coexistence de multiples espèces dans une communauté.

Essais de co-culture sans contact pour explorer les interactions entre espèces
Les molécules solubles de signalisation extracellulaire, présentes en faible abondance, interviennent souvent dans des événements clés de communication lors de la cohabitation microbienne mixte. Ces dynamiques ont été évaluées à l’aide de deux dispositifs cellulaires sans contact, conçus pour analyser les schémas d’interaction entre C. albicans et C. glabrata, tout en empêchant tout contact physique direct entre cellules. La première configuration utilisait un système de culture en plaque à puits avec insert à membrane intégré, dans lequel les deux populations étaient séparées physiquement par une membrane de polycarbonate inerte poreuse de 0,4 µm, permettant une diffusion bidirectionnelle sans entrave des molécules sécrétées à travers la barrière. La seconde configuration a permis de suivre la croissance des cellules levuriennes de C. albicans cultivées directement dans des plaques de microtitration contenant un surnageant acellulaire prélevé à partir de cultures de C. glabrata en phase stationnaire (CgCFS).
Conformément aux criblages précédents30, les cellules diploïdes hétérozygotes de type sauvage de C. albicans (SC5314) ont facilement développé des hyphes véritables en réponse soit aux cellules de C. glabrata séparées par la barrière de l'insert membrane, soit au CgCFS filtré. En revanche, les cellules maintenues dans un milieu contrôle négatif pur (GMM ou YPD) sont restées principalement sous forme de levure bourgeonnante et de pseudohyphes (Figure 2A). Les analyses comparatives ont montré une cohérence entre les deux dispositifs de test. Les deux essais ont donné des valeurs comparables pour toutes les métriques structurales, notamment la longueur, le volume et l'épaisseur des filaments (Figure 2). La différence entre les paramètres morphologiques a été considérée comme significative si la valeur p issue des tests statistiques appropriés, suivis de tests post-hoc pour comparaisons multiples, atteignait le seuil de 0,05. Ces observations ont montré que les cellules de C. albicans ne présentaient pas de différence significative en ce qui concerne la longueur des hyphes véritables induits par les cellules de C. glabrata dans le système de plaque de puits avec insert membrane (39,66 µm ± 6,81 µm) ou lorsqu'elles étaient exposées au CgCFS filtré (37,13 µm ± 6,50 µm ; Figure 2B). De même, les volumes de ces filaments induits dans le système de plaque de puits avec insert membrane (112,10 µm3 ± 22,59 µm3) n'étaient pas significativement différents de ceux observés dans le milieu conditionné par le CgCFS (109,78 µm3 ± 34,69 µm3 ; Figure 2C). En outre, les mesures du diamètre des filaments ont confirmé que l'épaisseur moyenne des hyphes restait constante entre les deux dispositifs, avec des valeurs de 1,89 ± 0,10 µm pour la configuration de plaque de puits avec insert membrane et de 1,92 µm ± 0,23 µm pour le traitement au CgCFS (Figure 2D).
Les états de ploïdie et les configurations du type sexuel modifient les dimensions morphologiques in vitro
Les rôles des niveaux de ploïdie et des architectures du locus d'accouplement dans la régulation des transitions dimorphiques ont été établis dans différents systèmes modèles de champignons. Ici, un pipeline analytique de suivi a été appliqué pour quantifier les paramètres de filamentation, notamment la longueur des hyphes, le volume structural, l'épaisseur et le volume correspondant de la cellule levurique mère, chez un ensemble de souches haploïdes (MATa ou MATα) et diploïdes (MATa/a, MATα/α ou MATa/α) de C. albicans.
Le profilage structural a révélé que, suite à l'exposition au sécrétome inducteur de CgCFS ou au sérum témoin positif, la souche diploïde homozygote alpha (MATα/α) formait des filaments ayant des axes significativement plus longs (45,56 µm ± 9,24 µm et 46,62 µm ± 9,07 µm) et un volume plus important (125,24 µm3 ± 39,94 µm3 et 119,45 µm3 ± 37,32 µm3), comparée à la souche diploïde homozygote MATa/a (Figure 3A,C). Bien que les isolats cliniques standards de C. albicans existent principalement sous forme de diploïdes hétérozygotes, la souche témoin MATa/α présentait des filaments plus longs et des volumes plus grands par rapport à la souche MATa/a après induction (notamment avec le sérum). Toutefois, ces valeurs étaient significativement inférieures à celles observées chez la souche homozygote MATα/α (Figure 3B,D).
Parallèlement, les souches haploïdes ont montré un patron inverse, où la souche haploïde MATa présentait une augmentation significative de la longueur des hyphes par rapport à la souche haploïde MATα dans les deux conditions d'induction (CgCFS : 22,06 µm ± 5,41 µm contre 17,58 µm ± 4,12 µm ; sérum : 23,71 µm ± 6,59 µm contre 21,00 µm ± 5,29 µm ; Figure 4A). Fait intéressant, cette augmentation de la longueur dans le contexte haploïde se traduisait par une augmentation du volume des hyphes (38,84 µm3 ± 19,58 µm3 contre 34,25 µm3 ± 19,62 µm3) uniquement en réponse au CgCFS (Figure 4B). Ces premières mesures in vitro suggèrent une interaction complexe entre les états de ploïdie et les configurations du locus de type sexuel, indiquant que les locus MATa et MATα contribueraient probablement de manière différente à la dynamique de la filamentation.
Afin d'étudier les relations statistiques entre ces métriques structurelles au sein des jeux de données combinés, des analyses de corrélation de rang de Spearman (ρ) et de régression linéaire de Pearson (R2), incluant toutes les variantes de ploïdie et de type de reproduction testées, ont été réalisées. Des corrélations positives ont été observées pour toutes les paires analysées : longueur des hyphes par rapport au volume des hyphes, longueur des hyphes par rapport à l'épaisseur des hyphes, longueur des hyphes par rapport au volume de la cellule mère, et volume total des hyphes par rapport au volume de la cellule mère en forme de levure (Figure 5, Tableau supplémentaire 1 et Tableau supplémentaire 2).
La relation la plus forte a été observée entre la longueur des hyphes et le volume hyphal calculé (ρ = 0,91 ; Figure 5A). En revanche, la corrélation la plus faible concernait le volume initial de la cellule mère levurienne et le volume hyphal émergent (ρ = 0,63 ; Figure 5C). De plus, l'épaisseur hyphale ne corrélait pas aussi fortement avec la longueur hyphale que ne le faisait le volume hyphal (Figure 5A,D). Le volume de la cellule mère, la longueur hyphale et l'épaisseur hyphale ne présentaient pas de différences statistiquement significatives dans leurs corrélations (Figure 5B,D). Ces distributions géométriques suggèrent qu'un volume initial plus élevé de la cellule mère levurienne ne conduit pas nécessairement à des hyphes plus longs ou à un volume plus important.
En résumé, ces résultats démontrent l'utilité des plaques de puits avec inserts de membrane et des tests basés sur le CFS pour visualiser et quantifier les variations morphogénétiques chez C. albicans, sans aucun contact physique. Les données générées par ce protocole révèlent des caractéristiques morphologiques différentes selon les fonds génétiques de ploïdie et les configurations de type de reproduction. Ces dispositifs expérimentaux sans contact offrent une méthodologie souple et évolutible, adaptable à l'étude de la dynamique de signalisation interspécifique dans diverses combinaisons microbiennes.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71709/71709fig1.jpg" /> 
Figure 1&#160;: Représentation schématique des tests d'induction des hyphes par co-culture dans des plaques à inserts membranaires et à base de surnageants filtrés (CFS) avec des espèces de Candida. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71709/71709fig1large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71709/71709fig2.jpg" /> 
Figure 2 : Comparaison des morphologies hyphaliennes observées entre le système de plaque de puits avec insert de membrane et les tests sans contact basés sur le surnageant acellulaire (CFS). (A) Microphotographies représentatives en champ clair illustrant la réponse morphologique de C. albicans au YPD (témoin), à C. glabrata dans un dispositif de plaque de puits avec insert de membrane, ou au milieu conditionné par le surnageant acellulaire (CFS) de C. glabrata. Les flèches roses, noires et blanches indiquent respectivement les formes levuriques, les pseudohyphes et les hyphes véritables. Échelle, 10 µm. Longueurs des hyphes (B), volumes des hyphes (C) et épaisseur des hyphes (D) d'une souche diploïde hétérozygote de C. albicans (SC5314) observées en réponse aux cellules de C. glabrata dans un dispositif de plaque de puits avec insert de membrane ou au CFS de C. glabrata. Les données représentent la médiane ± intervalles de confiance à 95 %, issues de trois expériences biologiques indépendantes, avec n = 50 cellules. ns, non significatif : p &#62; 0,05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71709/71709fig2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour consulter une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71709/71709fig3.jpg" /> 
Figure 3&#160;: Le type de reproduction et la zygotie ont des effets significatifs sur la morphologie des hyphes chez le C. albicans diploïde. Graphiques représentant les longueurs comparatives des hyphes, en réponse à la molécule inductrice indiquée, entre diploïdes homozygotes (A) et entre diploïdes hétéro- et homozygotes (B) de C. albicans. De même, les volumes comparatifs des hyphes, en réponse aux molécules inductrices mentionnées, sont présentés entre diploïdes homozygotes (C) et entre diploïdes hétéro- et homozygotes (D). Témoin&#160;: YPD, milieu témoin ne favorisant pas l'induction des hyphes. Les données représentent la médiane ± intervalles de confiance à 95&#160;%, issues de trois expériences biologiques indépendantes, avec n = 50 cellules. Les valeurs numériques indiquées en haut des graphiques correspondent aux valeurs p, déterminées par des comparaisons selon le test de Wilcoxon. **&#160;: p &#60; 0,01, ***&#160;: p &#60; 0,001, ****&#160;: p &#60; 0,0001, significatif statistiquement&#160;; ns, non significatif&#160;: p &#62; 0,05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71709/71709fig3large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71709/71709fig4.jpg" /> 
Figure 4&nbsp;: Caractéristiques des hyphes chez C. albicans haploïde en réponse à différents inducteurs moléculaires. Les graphiques illustrent les longueurs des hyphes (A) et les volumes des hyphes (B) chez des souches d'C. albicans haploïdes, en réponse à l'inducteur indiqué. Témoin&nbsp;: YPD, milieu témoin ne favorisant pas l'induction des hyphes. Les données représentent la médiane ± intervalles de confiance à 95 %, issues de trois expériences biologiques indépendantes, avec n = 50 cellules. Les nombres indiqués correspondent aux valeurs de p, déterminées par le test de Wilcoxon. **&nbsp;: p &#60; 0,01, ***&nbsp;: p &#60; 0,001, ****&nbsp;: p &#60; 0,0001, significatif statistiquement&nbsp;; ns, non significatif&nbsp;: p &#62; 0,05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71709/71709fig4large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71709/71709fig5.jpg" /> 
Figure 5 : Corrélation entre les paramètres morphologiques associés à la ploïdie de C. albicans. Les graphiques montrent la corrélation de Spearman et la régression linéaire entre les paramètres morphologiques utilisés dans cette étude, à savoir le volume des hyphes et la longueur des hyphes (A), le volume cellulaire et la longueur des hyphes (B), le volume cellulaire et le volume des hyphes (C), ainsi que l'épaisseur des hyphes et la longueur des hyphes (D). ρ : coefficient de corrélation de Spearman ; R2 : coefficient de détermination issu de l'analyse de régression linéaire ; p : valeur p. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71709/71709fig5large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Souche</td>
			<td>Espèce</td>
			<td>Ploïdie</td>
			<td>Génotype</td>
			<td>Source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CBS138</td>
			<td>Candida glabrata</td>
			<td>Haploïde (1n)</td>
			<td>MATα</td>
			<td>ATCC 2001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SC5314</td>
			<td>Candida albicans</td>
			<td>Double (2n)</td>
			<td>Hétérozygote (MATa/α)</td>
			<td>ATCC MYA-2876</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBY1132</td>
			<td>Candida albicans</td>
			<td>Double (2n)</td>
			<td>Homozygote (MATa/a) ; arg4Δ/arg4Δ, leu2Δ/leu2Δ, his1Δ/his1Δ, URA3/ura3Δ</td>
			<td rowspan="2">Schaefer, D., Côte, P., Whiteway, M., Bennett, R.J. Barrier Activity in Candida albicans Mediates Pheromone Degradation and Promotes Mating. Eukaryotic Cell. 6 (6), 907–918, doi: 10.1128/ec.00090-07 (2007).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBY1133</td>
			<td>Candida albicans</td>
			<td>Double (2n)</td>
			<td>Homozygote (MATα/α) ; arg4Δ/arg4Δ, leu2Δ/leu2Δ, his1Δ/his1Δ, URA3/ura3Δ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GZY896</td>
			<td>Candida albicans</td>
			<td>Haploïde (1n)</td>
			<td>Homozygote (MATa) ; ura3∆::imm434 his4 gal1∆::ura3∆::HIS4</td>
			<td rowspan="2">Hickman, M.A. et al. Le « diploïde obligatoire » Candida albicans forme des haploïdes compétents pour la reproduction. Nature. 494 (7435), 55–59, doi: 10.1038/nature11865 (2013).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GZY803</td>
			<td>Candida albicans</td>
			<td>Haploïde (1n)</td>
			<td>Homozygote (MATα) ; his4 ura3Δ::HIS4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tableau 1 : Souches de Candida albicans et Candida glabrata utilisées dans cette étude. Le tableau présente les désignations, les génotypes explicites, les états de ploïdie et la zygotie du type d'accouplement des souches fongiques évaluées dans les essais de co-culture en plaque à puits avec insert de membrane sans contact et basés sur des surnageants cellulaires libres (CFS).
Tableau supplémentaire 1 : Données des analyses statistiques effectuées sur divers paramètres morphologiques de C. albicans. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71709/Supplemental Table S1.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Tableau supplémentaire 2 : Valeurs brutes de tous les réplicats biologiques des différents paramètres morphologiques de C. albicans évalués dans cette étude.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71709/Supplemental Table S2.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Fichier supplémentaire 1 : Liste des milieux utilisés dans cette étude avec leurs compositions.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71709/Supplemental File 1.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>

Deux approches de co-culture sans contact sont décrites pour l'évaluation qualitative et quantitative des réponses morphologiques fongiques durant des interactions interspécifiques. Le protocole montre comment les facteurs intrinsèques influencent la croissance des hyphes, en utilisant un test interspécifique de Candida comme exemple. Ces méthodes peuvent être facilement adaptées pour étudier la communication interspécifique microbienne chez des organismes variés.

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Nous étudions la communication moléculaire dans les interactions hôte-pathogène et entre espèces fongiques, en nous interrogeant sur la manière dont les signaux sécrétés modulent la morphologie et le comportement microbien. Les méthodes existantes peuvent être laborieuses, coûteuses ou difficiles à interpréter. Ce protocole propose un essai simple, adaptable et sans contact pour étudier de nouvelles interactions microbienne inter-espèces. Ce protocole soutient la recherche fondamentale et translationnelle sur les interactions inter-espèces et inter-règnes dans divers systèmes biologiques et cliniques.Commencez par placer une boîte de Pétri contenant un milieu minimal au glucose agar avec des colonies de Candida glabrata CBS 138, une anse stérile et un tube contenant du bouillon stérile d’extrait de levure, peptone, dextrose, ou bouillon YPD, à l’intérieur de la hotte de sécurité biologique. Prélevez une colonie isolée unique à partir de la boîte et inoculez-la dans 10 millilitres de bouillon YPD. Incubez à 37 degrés Celsius avec agitation continue à 200 tr/min pendant 18 heures. Prélevez la culture de nuit. Vérifiez la morphologie des levures et l’absence de contamination par microscopie optique. Transférez la culture dans un tube conique de 15 millilitres. Centrifugez à 5 000 x g pendant cinq minutes à 25 degrés Celsius. Jetez délicatement le surnageant et conservez le culot cellulaire pour le test avec insert de membrane. Pour la souche cible Candida albicans, inoculez une colonie unique dans 5 millilitres de bouillon GMM pour une souche diploïde, ou dans du bouillon YPD pour une souche haploïde. Incubez la culture inoculée à 37 degrés Celsius avec agitation à 200 tr/min pendant 12 heures. Vérifiez la densité optique de la culture de nuit à 600 nanomètres. Ensuite, diluez la culture avec du bouillon GMM préchauffé jusqu’à un volume final de 1 millilitre et une DO finale de 0,1 à 600 nanomètres.Prenez une plaque de culture tissulaire stérile de 24 puits. Ajoutez 1 millilitre de suspension de Candida albicans ayant une DO à 600 nanomètres de 0,1 dans chaque puit inférieur sélectionné, ou chambre abdominale d'une plaque de culture cellulaire à double compartiment. Ensuite, récupérez le culot de Candida glabrata et resuspendez-le dans 1 millilitre de bouillon GMM. Effectuez une centrifugation à 5 000 x g pendant 3 minutes et jetez le surnageant. Répétez le lavage deux fois. Resuspendez le culot final dans du bouillon GMM frais, puis ajustez la DO à 600 nanomètres de la suspension cellulaire à cinq. Ensuite, à l’aide de pinces stériles, placez un insert membraneux stérile doté d’une membrane en polycarbonate de 0,4 micromètre de porosité dans chaque puit de travail. Fixez fermement l’insert dans les puits et ajoutez 750 microlitres de la suspension préparée de Candida glabrata dans chaque chambre supérieure ou luminale. Recouvrez la plaque assemblée et incubez-la à 37 degrés Celsius, sans agitation, pendant trois heures. Après l’incubation, utilisez des pinces stériles pour retirer chaque insert supérieur et éliminez-le en toute sécurité. Placez la plaque de 24 puits sur un microscope inversé équipé d’optiques DIC et d’objectifs à distance de travail extra-longue de 10x, 20x et 40x pour l’évaluation morphologique.Après la période d'incubation requise, balayer le fond des puits avec l'objectif 10x afin de vérifier une distribution uniforme des cellules et d'identifier les erreurs de suivi ou les regroupements anormaux. Capturer au moins 10 champs distincts à l'aide de l'objectif 20x calibré pour constituer le jeu de données principal relatif au nombre de filaments et à la distribution des populations. Pour une analyse phénotypique fine et des mesures des limites cellulaires, acquérir des microphotographies à l'aide de l'objectif 40x à distance de travail extra-longue. Ensuite, sauvegarder tous les fichiers d'images brutes. Lancer la dernière version du logiciel Fiji. Ouvrir la microphotographie cible en sélectionnant Fichier, puis Ouvrir. Pour mesurer la longueur des hyphes, cliquer sur l'icône de sélection Ligne et choisir l'outil Ligne segmentée. Placer le curseur au niveau de la jonction où le filament émerge de la paroi de la cellule mère levurienne. Tracer l'axe longitudinal central de l'hyphe, en ajoutant des points d'ancrage pour suivre les courbures et les coudes, et terminer au niveau de l'extrémité apicale. Exécuter la commande de mesure en appuyant sur Contrôle + M sous Windows ou Commande + M sous Mac OS afin d'enregistrer la longueur totale, L, en micromètres dans la fenêtre Résultats. Utiliser l'outil Pinceau pour marquer la cellule mesurée et éviter une analyse en double. Localiser sa cellule mère levurienne attachée. À l'aide de l'outil Ligne segmentée, tracer et mesurer une ligne droite le long de l'axe longitudinal maximal de la cellule afin d'enregistrer l'axe majeur, A. Puis tracer et mesurer une ligne perpendiculaire à l'axe majeur traversant l'étendue transversale la plus large pour enregistrer l'axe mineur, B. Calculer le volume de la cellule mère levurienne, CV, en micromètres cubes, en utilisant le modèle de sphéroïde prolate intégré au logiciel. Pour mesurer l'épaisseur de l'hyphe, utiliser l'outil Ligne segmentée pour tracer une ligne d'extérieur à extérieur de la paroi, perpendiculaire à l'axe longitudinal de l'hyphe. Enregistrer le diamètre à trois positions équidistantes le long du filament. Calculer la moyenne arithmétique des trois diamètres afin d'obtenir l'épaisseur moyenne, d, puis diviser cette valeur par 2 pour obtenir le rayon, r. Calculer le volume total de l'hyphe, HV, en micromètres cubes, en traitant le filament non ramifié comme un cylindre.Calculez la mesure cellulaire moyenne ou médiane pour chaque réplicat biologique, et utilisez ces valeurs au niveau des réplicats pour les comparaisons statistiques ultérieures. Avant d'appliquer des méthodes paramétriques, évaluez la normalité du jeu de données des réplicats biologiques à l'aide du test de Shapiro-Wilk ou du test de D'Agostino-Pearson. Pour une comparaison entre deux groupes, utilisez un test t de Student non apparié bilatéral lorsque le jeu de données suit une distribution normale. Après avoir effectué les analyses statistiques et préparé les représentations graphiques, appliquez des notations statistiques cohérentes sur l'ensemble des figures.Les cellules de Candida albicans ont développé de vrais hyphes dans deux systèmes d'essai sans contact, soit lorsqu'elles étaient exposées à des cellules de Candida glabrata séparées par une membrane, soit à un surnageant acellulaire filtré de Candida glabrata. Les cellules témoins, en revanche, conservaient principalement des morphologies levuriennes et pseudohyphales. Aucune différence significative n'a été observée entre les essais de co-culture avec membrane et de surnageant acellulaire filtré, les deux produisant des longueurs, des volumes et des épaisseurs d'hyphes comparables.Le protocole permet aux chercheurs d'étudier la coexistence multispecies en mesurant les réponses morphologiques aux signaux interspécifiques au sein des communautés microbiennes. Le défi principal réside dans l'assurance des échanges moléculaires à travers la membrane, ce qui pourrait être résolu par une agitation de la plaque et le maintien d'une pression hydrostatique suffisante. L'imagerie de cellules vivantes des dynamiques des organites pourrait révéler comment la communication moléculaire façonne mécanistiquement les interactions interspécifiques.

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