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</ol>

<table><tbody><tr><td>0.25% Trypsin-EDTA Solution</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td>pour la dissociation des tissus et la préparation de suspensions de cellules uniques</td></tr><tr><td>100% Éthanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459844</td><td>pour le nettoyage de l'ARN</td></tr><tr><td>AffinityScript Reverse Transcriptase</td><td>Agilent</td><td>600107</td><td>pour la synthèse de l'ADNc eCLIP</td></tr><tr><td>Anticorps Anti-CCT3</td><td>Abcam</td><td>Ab225878</td><td>anticorps pour eCLIP</td></tr><tr><td>Anticorps Anti-PABPC1</td><td>Abcam</td><td>Ab312314</td><td>anticorps pour eCLIP&nbsp;</td></tr><tr><td>Chloroforme</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td>pour l'extraction de l'ARN</td></tr><tr><td>Collagénase de Type IV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5138</td><td>pour la dissociation enzymatique des tissus testiculaires</td></tr><tr><td>Réactifs de déphosphorylation (T4 PNK)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201S</td><td>pour la déphosphorylation de l'ARN eCLIP</td></tr><tr><td>Milieu DMEM à haute teneur en glucose</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td>pour la culture cellulaire et le tampon de dissociation des tissus</td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1 Perles magnétiques</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>65001</td><td>pour la capture des complexes sonde-ARN-protéine biotinylés</td></tr><tr><td>Magnet DynaMag-15</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12301D</td><td>pour la séparation des perles magnétiques</td></tr><tr><td>Magnet DynaMag-2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12321D</td><td>pour la séparation des perles magnétiques</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td>pour la chélation des cations divalents dans les tampons de lyse et de lavage</td></tr><tr><td>Exonuclease I</td><td>New England Biolabs</td><td>M0293S</td><td>pour la purification de l'ADNc eCLIP</td></tr><tr><td>Sérum bovin foetal (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10099141C</td><td>pour arrêter la digestion trypsique</td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9342</td><td>pour la préparation du tampon d'hybridation</td></tr><tr><td>Four d'hybridation</td><td>TUOHE</td><td>LF-I</td><td>pour l'hybridation des sondes et le lavage des billes</td></tr><tr><td>Agarose à basse température de fusion</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9414</td><td>pour la sélection de la taille de la bibliothèque eCLIP</td></tr><tr><td>Kit d'extraction de gel MinElute</td><td>Qiagen</td><td>28604</td><td>pour la sélection de la taille de la bibliothèque eCLIP</td></tr><tr><td>Kit miRNeasy Mini</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td>pour la purification de l'ARN</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>pour la préparation du tampon de lavage à haute concentration en sel</td></tr><tr><td>Membrane de nitrocellulose</td><td>GE Healthcare / Amersham</td><td>10600002</td><td>pour le transfert de western blot eCLIP</td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>85125</td><td>pour le détergent du tampon de lavage</td></tr><tr><td>Eau libre de nucléase et de protéase</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10977035</td><td>pour la préparation des solutions exemptes de nucléase</td></tr><tr><td>Gel Bis-Tris NuPAGE 4-12%</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0322BOX</td><td>pour la sélection de la taille eCLIP</td></tr><tr><td>Gels pré-moulés NuPAGE Bis-Tris</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0321BOX</td><td>pour la séparation des protéines par SDS-PAGE</td></tr><tr><td>PBS (pH 7,4)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td>pour le lavage et la remise en suspension des cellules</td></tr><tr><td>Fluorure de phénylméthanesulfonyle (PMSF)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626</td><td>inhibiteur de protéase à sérine pour le tampon de lyse cellulaire ; ajouté frais avant utilisation</td></tr><tr><td>Cocktail d'inhibiteurs de protéase</td><td>Roche</td><td>4693132001</td><td>inhibiteur de protéase à large spectre pour le tampon de lyse cellulaire ; ajouté frais avant utilisation</td></tr><tr><td>Protéinase K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4850</td><td>pour la digestion des protéines dans l'extraction de l'ARN</td></tr><tr><td>Mélange Master qRT-PCR</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11704044</td><td>pour la RT-PCR quantitative pour confirmer l'enrichissement de l'ARN</td></tr><tr><td>Solution de DNase I sans RNase/protéase</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EN0521</td><td>pour la dissociation des tissus</td></tr><tr><td>Kit RNeasy Mini</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>pour la purification de l'ARN</td></tr><tr><td>Tampon de chargement d'échantillon SDS-PAGE</td><td>Beyotime</td><td>P0286</td><td>pour la préparation des échantillons de protéines</td></tr><tr><td>Phosphatase alcaline de crevette</td><td>New England Biolabs</td><td>M0371S</td><td>pour la purification de l'ADNc eCLIP</td></tr><tr><td>Kit de coloration argentique</td><td>Beyotime</td><td>P00175</td><td>pour la visualisation des protéines dans les gels SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Déoxycholate de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750</td><td>pour le détergent du tampon de lavage</td></tr><tr><td>Dodécylsulfate de sodium (SDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771</td><td>pour la lyse cellulaire et la dénaturation des protéines</td></tr><tr><td>Superase-in Inhibiteur de RNase</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM2694</td><td>inhibiteur spécialisé de la RNase ; ajouté frais avant utilisation</td></tr><tr><td>T4 RNA Ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0204</td><td>pour la liaison de l'adaptateur eCLIP</td></tr><tr><td>Tris–HCl (pH 7,0)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5941</td><td>pour la préparation des tampons de lyse, d'hybridation et de lavage</td></tr><tr><td>Réactif TRIzol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596026CN</td><td>pour l'extraction de l'ARN</td></tr><tr><td>Écraseur cellulaire à ultrasons</td><td>ATPIO</td><td>ATPIO-650D</td><td>pour la lyse cellulaire et la fragmentation de l'ADN</td></tr><tr><td>Appareil de réticulation ultraviolet</td><td>Analytik Jena</td><td>UVP CL-1000</td><td>pour la réticulation UV des interactions ARN-protéine</td></tr><tr><td>urée</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U5128</td><td>pour la dégradation des protéines eCLIP sur membrane</td></tr></tbody></table>

une méthode chirp à base d’uv pour l’identification vérifiable des protéines qui interagissent directement avec lncrna : des cellules cultivées au testicule de souris

A UV-Based ChIRP Method For The Verifiable Identification of Proteins That Directly Interact With LncRNA: From Cultured Cells To Mouse Testis

Une méthode chIRP à base d’UV pour l’identification vérifiable des protéines qui interagissent directement avec lncRNA : des cellules cultivées au testicule de souris

Long non-coding RNAs (lncRNAs) have emerged as important regulators of diverse biological processes. However, the molecular mechanisms underlying the ...

Notre recherche a mis au point la méthode cPDiRT, une technique de réticulation par UV permettant de cartographier directement les interactions ARN-protéines dans des cellules cultivées ainsi que dans des tissus natifs, comme les testicules, et d'élucider les mécanismes moléculaires de TUG1 dans la spermatogenèse. Ce protocole permet de cartographier directement les interactions ARN-protéine dans un large éventail de systèmes, allant des cellules cultivées à des tissus natifs intacts. Pour commencer, lavez les cellules GC2 trois fois avec du PBS afin d'éliminer le milieu de culture résiduel.Ensuite, ajoutez trois millilitres de PBS dans la boîte et répartissez-les uniformément avant la réticulation. Exposez les cellules à un réticulateur ultraviolet de 254 nanomètres à une dose de 4 000 millijoules par centimètre carré. Récupérez les cellules dans le PBS et centrifugez la suspension cellulaire à 3000G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.Après avoir éliminé le surnageant, peser le culot et vérifier une masse minimale de 500 milligrammes par échantillon. Prélever les testicules de souris mâles C57BL6 âgées de quatre semaines. Laver deux fois le tissu testiculaire décapsulé avec 5 à 10 millilitres de DMEM.Ensuite, incuber 100 milligrammes de tissu avec 10 millilitres de DMEM contenant 1 milligramme par millilitre de collagénase IV à 37 degrés Celsius. Poursuivre la digestion pendant 5 à 15 minutes jusqu'à ce que les tubules séminifères soient libérés. Ensuite, centrifuger la suspension à 1000G pendant une minute à quatre degrés Celsius et éliminer le surnageant.Lavez le culot avec 5 à 10 millilitres de DMEM. Centrifugez de nouveau la suspension à 1000G pendant une minute à quatre degrés Celsius. Resuspendez ensuite le culot dans de la trypsine à 0,25 % contenant un milligramme par millilitre d'ADNase I. Incubez la suspension à 37 degrés Celsius pendant 5 à 15 minutes.Ensuite, ajoutez un volume égal de DMEM supplémenté avec 10 % de FBS pour arrêter la digestion enzymatique. Filtrez la suspension à l’aide d’un tamis cellulaire de 70 micromètres. Centrifugez les cellules à 2000G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.Jetez le surnageant et lavez le culot avec 5 à 10 millilitres de PBS. Centrifugez de nouveau la suspension à 2000G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Resuspendez la suspension de cellules uniques dans du PBS et répartissez-la uniformément dans une boîte de culture de 15 centimètres.Liez chimiquement les cellules testiculaires comme indiqué précédemment pour les cellules GC2. Omettez l'irradiation pour les cellules témoins. Récupérez les cellules réticulées.Centrifuger la suspension à 3000G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius et éliminer le surnageant. Assurer une masse minimale de culot de 500 milligrammes en regroupant les cellules testiculaires isolées d’au moins 10 à 12 souris. Après avoir pesé le culot, le resuspendre dans un tampon de lyse cellulaire selon un rapport de 100 milligrammes de culot pour un millilitre de tampon.Après vortexage, soniquez l'échantillon à l'aide d'un ultrasonicateur focalisé ou d'un bain à ultrasons jusqu'à ce que le lysat devienne visuellement clair. Ensuite, aliquotez environ 10 microlitres du lysat dans des tubes de microcentrifugeuse pour l'analyse de l'ARN et des protéines. Ajoutez 30 microlitres de billes magnétiques pré-lavées au lysat.Incuber les échantillons à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes avec un mélange doux dans un four d'hybridation. Placer les échantillons sur un support magnétique pendant environ une minute ou jusqu'à ce que la solution devienne limpide. Transférer le lysat clarifié dans un tube neuf.Placer le nouveau tube sur le support magnétique. Ensuite, transférer le lysat dans un autre tube afin d'éliminer les billes résiduelles. Ajouter deux volumes de tampon d'hybridation préchauffé à 37 degrés Celsius à chaque échantillon.Ajouter des sondes d'ADN biotinylées à raison d'un microlitre de solution mère de sonde à 100 micromolaire par millilitre de lysat. Incuber les échantillons à 37 degrés Celsius avec une rotation bout à bout pendant 12 à 16 heures dans un four d'hybridation. Juste avant utilisation, laver 100 microlitres de billes magnétiques streptavidine trois fois avec du tampon de lyse cellulaire.Et éliminer le tampon résiduel après le dernier lavage. Centrifuger brièvement les tubes de réaction d'hybridation. Ensuite, ajouter l'échantillon hybridé aux billes lavées et mélanger délicatement.Replacer la suspension de billes dans le tube d'origine et incuber à 37 degrés Celsius avec agitation pendant 30 à 40 minutes. Après l'incubation, centrifuger brièvement les échantillons. Placer les tubes sur un support magnétique pendant une à deux minutes, ou jusqu'à ce que la solution devienne claire.Ensuite, jetez le surnageant. Pour laver les billes, ajoutez un millilitre du tampon de lavage et incubez les tubes dans l’étuve d’hybridation à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Après cinq lavages, transférez 1 à 10 % des billes dans un tube neuf pour l’analyse de l’ARN.Enfin, ajoutez 40 microlitres de tampon d'échantillonnage SDS 1X aux billes restantes. Portez les échantillons à ébullition à 95 degrés Celsius pendant 30 minutes afin d'éluer les protéines et de rompre les liaisons de réticulation. Récupérez les protéines pour une analyse en spectrométrie de masse en aval.L'analyse par spectrométrie de masse ChIRP a identifié plus de 190 protéines enrichies par rapport au témoin négatif dans les cellules GC2. À une dose de rayonnement UV de 4 000 millijoules par centimètre carré, la cPDiRT-MS a identifié un ensemble de protéines plus sélectif. Plus des deux tiers de ces protéines présentaient un recouvrement avec celles identifiées par la ChIRP-MS conventionnelle.La plupart des protéines identifiées avec au moins deux peptides uniques ont été détectées de manière reproductible parmi les réplicats biologiques, tant dans les cellules GC2 que dans les testicules de souris. L'analyse de l'ontologie génique des protéines identifiées de façon reproductible a révélé des processus biologiques globalement cohérents avec les fonctions connues de TUG1. La comparaison des jeux de données provenant des cellules GC2 et des testicules de souris a permis d'identifier 15 protéines enrichies de manière commune.Le séquençage amélioré par immunoprécipitation avec réticulation a révélé des pics de liaison clairs et spécifiques sur le transcrit TUG1 pour PABPC1 et CCT3. cPDiRT permet aux chercheurs d'identifier et de quantifier les protéines qui interagissent directement avec un ARN lié spécifique, tant dans les cellules en culture que dans les tissus natifs. Le défi le plus important consiste à obtenir une réticulation efficace par UV tout en assurant une grande spécificité pour les interactions directes entre ARN et protéines.Notre protocole soutiendra les études futures visant à appliquer cette approche à d'autres ARN et aux tissus dans le cadre de la réactivation directe de l'ARN en protéines lors du développement et de la reproduction.

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Une étape par étape pour le protocole isolement et l'identification des complexes ARN associés via RIP-Chip.

Méthode pour l&#39;isolement et l&#39;identification des ARNm, les microARN et composants protéiques des complexes ribonucléoprotéiques partir d&#39;extraits cellulaires utilisant RIP-Chip

CHIRP est une nouvelle technique et rapide à la carte génomique des sites de liaison de l'ARN non codantes de longues (lncRNAs). La méthode tire parti de la spécificité des oligonucléotides carrelage anti-sens pour permettre le dénombrement des sites génomiques lncRNA assortis.

Isolement de la chromatine par purification d&#39;ARN (CHIRP)

Nous présentons une variante de l'RAPIDE (immunoprécipitation quantitative Combiné avec Knockdown) approche qui a déjà été introduite pour distinguer entre les vraies et les fausses interactions protéine-protéine. Notre approche est basée...

Un protocole pour l&#39;identification des interactions protéine-protéine Basé sur<sup&gt; 15</sup&gt; N marquage métabolique, immunoprécipitation, la spectrométrie de masse quantitative et d&#39;affinité de modulation

Cette vidéo présente la méthode eCLIP (Enhanced Crosslinking Immunoprecipitation) pour identifier les protéines de liaison à l’ARN dans les testicules de souris. eCLIP permet l’identification précise des sites de liaison où les protéines de liaison à l’ARN (RBP) interagissent avec leurs ARN cibles.

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Identification des protéines d&#39;interaction partenaires dans les cellules de mammifères à l&#39;aide SILAC-immunoprécipitation quantitatives en protéomique

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Cette méthode de menu déroulant RNA permet d’identifier les cibles de RNA d’un ARN long non codantes (lncRNA). Basé sur l’hybridation du fait maison, conçues anti-sens ADN sondes oligonucléotidiques spécifiques à cette lncRNA dans un tissu convenablement fixe ou une lignée cellulaire, elle permet efficacement la capture de toutes les cibles de RNA de la lncRNA.

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Ce rapport décrit une méthode rapide et fiable pour la validation de cibles ARNm des miARN cellulaire. La méthode utilise biotinylé synthétique basé sur Locked Nucleic Acid LNA miRNA imite pour capturer les cibles ARNm. Par la suite, streptavidine des billes magnétiques travaillent à menu déroulant la cible ADN messagère pour la quantification par qPCR polymerase chain reaction.

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Ici, nous présentons un protocole eCLIP pour déterminer les principales cibles d’ARN des candidats du RBP dans les testicules.

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