Une méthode chIRP à base d’UV pour l’identification vérifiable des protéines qui interagissent directement avec lncRNA : des cellules cultivées au testicule de souris

Notre recherche a mis au point la méthode cPDiRT, une technique de réticulation par UV permettant de cartographier directement les interactions ARN-protéines dans des cellules cultivées ainsi que dans des tissus natifs, comme les testicules, et d'élucider les mécanismes moléculaires de TUG1 dans la spermatogenèse. Ce protocole permet de cartographier directement les interactions ARN-protéine dans un large éventail de systèmes, allant des cellules cultivées à des tissus natifs intacts. Pour commencer, lavez les cellules GC2 trois fois avec du PBS afin d'éliminer le milieu de culture résiduel.

Ensuite, ajoutez trois millilitres de PBS dans la boîte et répartissez-les uniformément avant la réticulation. Exposez les cellules à un réticulateur ultraviolet de 254 nanomètres à une dose de 4 000 millijoules par centimètre carré. Récupérez les cellules dans le PBS et centrifugez la suspension cellulaire à 3000G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.

Après avoir éliminé le surnageant, peser le culot et vérifier une masse minimale de 500 milligrammes par échantillon. Prélever les testicules de souris mâles C57BL6 âgées de quatre semaines. Laver deux fois le tissu testiculaire décapsulé avec 5 à 10 millilitres de DMEM.

Ensuite, incuber 100 milligrammes de tissu avec 10 millilitres de DMEM contenant 1 milligramme par millilitre de collagénase IV à 37 degrés Celsius. Poursuivre la digestion pendant 5 à 15 minutes jusqu'à ce que les tubules séminifères soient libérés. Ensuite, centrifuger la suspension à 1000G pendant une minute à quatre degrés Celsius et éliminer le surnageant.

Lavez le culot avec 5 à 10 millilitres de DMEM. Centrifugez de nouveau la suspension à 1000G pendant une minute à quatre degrés Celsius. Resuspendez ensuite le culot dans de la trypsine à 0,25 % contenant un milligramme par millilitre d'ADNase I. Incubez la suspension à 37 degrés Celsius pendant 5 à 15 minutes.

Ensuite, ajoutez un volume égal de DMEM supplémenté avec 10 % de FBS pour arrêter la digestion enzymatique. Filtrez la suspension à l’aide d’un tamis cellulaire de 70 micromètres. Centrifugez les cellules à 2000G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.

Jetez le surnageant et lavez le culot avec 5 à 10 millilitres de PBS. Centrifugez de nouveau la suspension à 2000G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Resuspendez la suspension de cellules uniques dans du PBS et répartissez-la uniformément dans une boîte de culture de 15 centimètres.

Liez chimiquement les cellules testiculaires comme indiqué précédemment pour les cellules GC2. Omettez l'irradiation pour les cellules témoins. Récupérez les cellules réticulées.

Centrifuger la suspension à 3000G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius et éliminer le surnageant. Assurer une masse minimale de culot de 500 milligrammes en regroupant les cellules testiculaires isolées d’au moins 10 à 12 souris. Après avoir pesé le culot, le resuspendre dans un tampon de lyse cellulaire selon un rapport de 100 milligrammes de culot pour un millilitre de tampon.

Après vortexage, soniquez l'échantillon à l'aide d'un ultrasonicateur focalisé ou d'un bain à ultrasons jusqu'à ce que le lysat devienne visuellement clair. Ensuite, aliquotez environ 10 microlitres du lysat dans des tubes de microcentrifugeuse pour l'analyse de l'ARN et des protéines. Ajoutez 30 microlitres de billes magnétiques pré-lavées au lysat.

Incuber les échantillons à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes avec un mélange doux dans un four d'hybridation. Placer les échantillons sur un support magnétique pendant environ une minute ou jusqu'à ce que la solution devienne limpide. Transférer le lysat clarifié dans un tube neuf.

Placer le nouveau tube sur le support magnétique. Ensuite, transférer le lysat dans un autre tube afin d'éliminer les billes résiduelles. Ajouter deux volumes de tampon d'hybridation préchauffé à 37 degrés Celsius à chaque échantillon.

Ajouter des sondes d'ADN biotinylées à raison d'un microlitre de solution mère de sonde à 100 micromolaire par millilitre de lysat. Incuber les échantillons à 37 degrés Celsius avec une rotation bout à bout pendant 12 à 16 heures dans un four d'hybridation. Juste avant utilisation, laver 100 microlitres de billes magnétiques streptavidine trois fois avec du tampon de lyse cellulaire.

Et éliminer le tampon résiduel après le dernier lavage. Centrifuger brièvement les tubes de réaction d'hybridation. Ensuite, ajouter l'échantillon hybridé aux billes lavées et mélanger délicatement.

Replacer la suspension de billes dans le tube d'origine et incuber à 37 degrés Celsius avec agitation pendant 30 à 40 minutes. Après l'incubation, centrifuger brièvement les échantillons. Placer les tubes sur un support magnétique pendant une à deux minutes, ou jusqu'à ce que la solution devienne claire.

Ensuite, jetez le surnageant. Pour laver les billes, ajoutez un millilitre du tampon de lavage et incubez les tubes dans l’étuve d’hybridation à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Après cinq lavages, transférez 1 à 10 % des billes dans un tube neuf pour l’analyse de l’ARN.

Enfin, ajoutez 40 microlitres de tampon d'échantillonnage SDS 1X aux billes restantes. Portez les échantillons à ébullition à 95 degrés Celsius pendant 30 minutes afin d'éluer les protéines et de rompre les liaisons de réticulation. Récupérez les protéines pour une analyse en spectrométrie de masse en aval.

L'analyse par spectrométrie de masse ChIRP a identifié plus de 190 protéines enrichies par rapport au témoin négatif dans les cellules GC2. À une dose de rayonnement UV de 4 000 millijoules par centimètre carré, la cPDiRT-MS a identifié un ensemble de protéines plus sélectif. Plus des deux tiers de ces protéines présentaient un recouvrement avec celles identifiées par la ChIRP-MS conventionnelle.

La plupart des protéines identifiées avec au moins deux peptides uniques ont été détectées de manière reproductible parmi les réplicats biologiques, tant dans les cellules GC2 que dans les testicules de souris. L'analyse de l'ontologie génique des protéines identifiées de façon reproductible a révélé des processus biologiques globalement cohérents avec les fonctions connues de TUG1. La comparaison des jeux de données provenant des cellules GC2 et des testicules de souris a permis d'identifier 15 protéines enrichies de manière commune.

Le séquençage amélioré par immunoprécipitation avec réticulation a révélé des pics de liaison clairs et spécifiques sur le transcrit TUG1 pour PABPC1 et CCT3. cPDiRT permet aux chercheurs d'identifier et de quantifier les protéines qui interagissent directement avec un ARN lié spécifique, tant dans les cellules en culture que dans les tissus natifs. Le défi le plus important consiste à obtenir une réticulation efficace par UV tout en assurant une grande spécificité pour les interactions directes entre ARN et protéines.

Notre protocole soutiendra les études futures visant à appliquer cette approche à d'autres ARN et aux tissus dans le cadre de la réactivation directe de l'ARN en protéines lors du développement et de la reproduction.