Name: Principes de la recombinase site-spécifique (SSR) Technologie (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-05-29T12:11:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: Découvrez la technologie des recombinases site-spécifiques (SSR) et le système Cre/lox pour l'ingénierie génomique avancée. Cette méthode permet la mutagenèse conditionnelle et l'étude précise des fonctions géniques.

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principes de la recombinase site-spécifique (ssr) technologie

Principles of Site-Specific Recombinase (SSR) Technology

Recombinase site-spécifique (SSR) la technologie permet la manipulation de la structure génétique d&#39;explorer la fonction des gènes et est devenu un outil intégral de la biologie moléculaire. Recombinases site-spécifiques sont des protéines qui se lient à différentes séquences cibles d&#39;ADN. Le système Cre / lox a d&#39;abord été décrite dans les bactériophages durant les années 1980. Recombinase Cre est un type topoisomérase I qui catalyse recombinaison spécifique de site d&#39;ADN entre deux loxP (locus de X-over P1) sites. Le système Cre / lox ne nécessite aucune cofacteurs. Séquences LoxP contiennent distinctes sites de liaison pour les recombinases Cre qui entourent une séquence centrale directionnelle, où la recombinaison et le réarrangement a lieu. Lorsque les cellules contiennent des sites loxP et expriment la recombinase Cre, un événement de recombinaison se produit. ADN double-brin est coupé à deux sites loxP par la recombinase Cre, réarrangés, et ligaturé (&quot;ciseaux et de colle»). Produits de l&#39;événement de recombinaison dépendent de l&#39;orientation relative des séquences asymétriques. La technologie RSS est souvent utilisé comme un outil pour explorer la fonction des gènes. Ici, le gène d&#39;intérêt est flanquée de Cre cible loxP sites (&quot;floxés&quot;). Les animaux sont ensuite croisés avec des animaux exprimant la recombinase Cre sous le contrôle d&#39;un promoteur tissu-spécifique. Dans les tissus qui expriment la recombinase Cre il se lie à des séquences cibles et accises du gène floxés. Délétion du gène contrôlé permet à l&#39;enquête sur la fonction des gènes dans les tissus spécifiques et à des moments distincts. Analyse de la fonction génique utilisant la technologie SSR --- mutagenèse conditionnelle - a des avantages significatifs par rapport traditionnelle knock-outs, où une délétion du gène est fréquemment mortelle.

L&#39;avènement de la recombinase site-spécifique (SSR) de technologie et le système Cre / lox a conduit à de nombreuses avancées en biologie moléculaire, et s&#39;est avéré un outil précieux pour évaluer la fonction des gènes dans des animaux transgéniques. Cette interview aborde le mécanisme de recombinaison site spécifique par cyclisation recombinase (Cre) et comment l&#39;utilisation de cette enzyme a conduit à l&#39;élaboration de mutagenèse conditionnelle, qui a des avantages significatifs par rapport knock traditionnelle des stratégies.

Principes de la recombinase site-spécifique (SSR) Technologie

La technologie des recombinases sito-spécifiques (SSR) permet de manipuler la structure des gènes pour explorer leur fonction et est devenue un outil essentiel de la biologie moléculaire...

Bonjour, je m'appelle Frank Buchholz. Je suis chef d'équipe à l'Institut Max PL de biologie cellulaire moléculaire et de génétique. Et nos travaux sont entretenus.Nous avons deux aspects dans notre travail. L'un concerne le criblage de l'ARN I. L'autre concerne le développement de recombinases spécifiques de site pour une ingénierie génomique avancée.Mon parcours est celui d'un biologiste, d'un biologiste moléculaire, ayant étudié la biologie du développement. J'ai ensuite effectué un doctorat aux Laboratoires européens de biologie moléculaire à Heidelberg, puis un postdoctorat à San Francisco à l'UCSF avec Mike Bishop, sur des modèles animaux de leucémie. L'Institut Max Puncture ici à Dresde cherche à combiner, disons, au moins deux aspects différents, à savoir la biologie du développement et la biologie cellulaire, dans le but fondamental, je dirais même le thème de base, de comprendre comment les cellules forment les tissus.C’est essentiellement l’objectif global de l’institut ici à Ston. Nous travaillons donc sur deux domaines principalement. L’un de ces domaines concerne la réalisation de cribles d’ARNi, visant à identifier de nouvelles fonctions de gènes auparavant non caractérisés dans des processus biologiques.L'autre concerne l'ingénierie génomique, visant à développer des technologies permettant une ingénierie sophistiquée des génomes à l'aide de recombinases spécifiques de site. Bien que les recombinases spécifiques de site aient été découvertes, dirais-je, dans les années quatre-vingt, par exemple la recombinase Cre avec laquelle nous travaillons, qui a été identifiée au début des années quatre-vingt. Il s'agit en réalité d'une protéine de bactériophage. Elle provient donc à l'origine d'un bactériophage, c'est-à-dire d'un virus qui infecte les bactéries.Il est donc très éloigné de ce qui est actuellement utilisé, mais on a très rapidement reconnu que ces enzymes peuvent remplir des fonctions très intéressantes exploitables dans d'autres organismes. Ainsi, les recombinases spécifiques de site sont des protéines qui se lient à l'ADN, spécifiquement à une séquence déterminée d'ADN, et lorsqu'elles se lient à ces séquences cibles, elles sont capables de couper l'ADN puis également de réarranger les sites, réalisant ainsi fondamentalement le processus de ligature. Encore une fois, vous pouvez réarranger des séquences d'ADN à l'aide de cette recombinaison spécifique de site, un peu comme des ciseaux et de la colle permettant fondamentalement d'assembler des séquences d'ADN d'une manière qui n'était pas possible auparavant.Ainsi, ces recombinases spécifiques de site, comme je l'ai dit, initialement découvertes chez les bactéries ou dans des bactéries, ont ensuite été testées pour voir si elles fonctionnaient également dans d'autres organismes. Et, fait intéressant, elles ont exercé leur fonction également dans d'autres organismes.Ainsi, si vous avez un site cible d'une recombinase spécifique au site dans un organisme que vous avez conçu, par exemple, ces enzymes accompliront leur fonction. L'utilisation très répandue de ces recombinases spécifiques au site, en particulier celles qui n'ont besoin d'aucun facteur cofacteur, comme la recombinase Flip ou la recombinase Cre que nous avons utilisées comme point de départ pour les travaux dont nous parlons ici aujourd'hui, réside dans leur capacité à fonctionner sans cofacteurs.Et si vous les exprimez, par exemple, dans un animal ou dans des cellules d'un animal, elles peuvent alors repérer les séquences qu'elles reconnaissent dans cet organisme et effectuer une coupure et un collage directement sur place, permettant ainsi l'excision de certaines séquences. Ce qui a été réalisé, ou plus précisément l'application réussie de cette enzyme, se situe notamment dans le domaine de la mutagenèse conditionnelle chez la souris. Par exemple, supposons que vous possédiez un gène dont vous savez qu'il est intéressant, et que vous souhaitiez déterminer la fonction de ce gène.Une expérience très importante consiste à produire une souris dite « knockout ». Pour celles et ceux qui l'ont récemment découverte, cette technologie a effectivement été récompensée par le prix Nobel cette année même, permettant de réaliser essentiellement une délétion génique chez la souris. Cependant, parfois, on observe qu'en inactivant un gène chez un animal, celui-ci s'avère être un gène essentiel et que la souris meurt très précocement durant l'embryogenèse.Ceci indique maintenant que votre gène est très important, mais cela ne précise pas réellement quelle est sa fonction. Une méthode très répandue actuellement consiste à réaliser un « knockout conditionnel ». Pour ce faire, vous encadrez votre gène d'intérêt avec des sites cibles destinés à ces recombinases spécifiques de site.Cela signifie que chez ces souris, le gène sera exprimé comme chez les souris de type sauvage. Mais si vous croisez ces souris avec une souris exprimant la recombinase CRE, par exemple sous un promoteur spécifique à un tissu, alors vous pouvez supprimer le gène d'intérêt uniquement dans des cellules spécifiques que vous pouvez prédéfinir en fonction de l'endroit où la recombinase est exprimée. Grâce à ces expériences, nous savons également que ces recombinaisons peuvent être très efficaces pour supprimer des séquences dans des organismes entiers.Et ceci constituait une condition préalable à notre idée d'essayer de développer une recombinase capable de couper au niveau du site que nous avions prédéfini, ce qui était jusqu'ici l'une des principales limitations empêchant le développement ultérieur du site. Pour les recombinases spécifiques, vous deviez concevoir le site cible de reconnaissance dans le génome d'une cellule d'un organisme que vous souhaitiez utiliser. Nous nous sommes donc demandé : pouvons-nous franchir cette barrière ?Fondamentalement, en utilisant l'évolution moléculaire. À l'heure actuelle, les recombinases spécifiques de site ne sont pas utilisées en thérapie, à ma connaissance. Comme je l'ai dit, c'est principalement parce qu'on ne dispose pas d'un site cible chez l'être humain qui serait reconnu par l'une des recombinases disponibles dans la nature.Il faut donc d'abord les modifier pour pouvoir les utiliser dans un cadre thérapeutique. Nous en sommes actuellement au tout début, et il n'est pas encore certain que cela soit possible. Le temps dira si nous sommes réellement capables de développer ces enzymes pour une utilisation thérapeutique, et le temps dira si cela est possible ou non.

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Courant VIH-1 stratégies agir pour supprimer le cycle de vie du virus mais ne éradiquer efficacement l'infection. Ici, nous démontrons que l'ingénierie peut ADN recombinase efficacement accise intégré le VIH-1 proviral dans le génome des cellules infectées.

Interview: le VIH-1 Excision ADN proviral utilisant une recombinase Evolved

La protéine de nucléoïde mitochondrial de la levure, Mgm101, est une protéine de recombinaison Rad52 type qui forme des gros anneaux oligomères. Un protocole est décrit pour préparer Mgm101 recombinant soluble avec la protéine de liaison du maltose (MBP)-tagging stratégie couplée avec échange de cations et la chromatographie d'exclusion stérique.

Préparation de la recombinaison de protéines Mgm101 par la stratégie de marquage MBP basée

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Sous-clonage plus insertion (SPI) - Un Recombineering nouveau procédé pour la construction rapide de ciblage de gène Vecteurs

Le minivecteur d’ADN linéaire fermé de manière covalente (LCC) (ministring d’ADN) est un vecteur de livraison de gènes non viral offrant une efficacité de transfection élevée et est pertinent pour toute application de livraison d’ADN. Le système de production est simple, rapide et évolutif in vivo. Le protocole suivant fournit des instructions visuelles étape par étape pour la production de mini-chaînes d’ADN.

Production de l&#39;ADN double brin Ministrings

Nous rapportons ici une méthode d'édition de gène rapide et efficace basée sur CREM dans le locus AAVS1 des cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs) qui améliore les systèmes décrits précédemment. En utilisant cette technique, les lignes isogéniques peuvent être rapidement et de manière fiable générés pour des études comparatives appropriées, ce qui facilite la recherche en transgénèse médiée avec hPSCs.

Génération rapide et efficace des Recombinant pluripotentes humaines cellules souches par recombinase médiée Cassette Exchange dans le<em&gt; AAVS1</em&gt; Locus

Nous présentons ici un protocole détaillé pour identifier les événements de recombinaison homologue qui s’est produite dans les cellules souches embryonnaires de souris à l’aide de Southern et/ou PCR. Cette méthode est illustrée par la génération de modèles murins non musculaires myosine II remplacement génétique à l’aide traditionnelle embryonnaire sur les cellules souches homologue induite par la recombinaison technologie de ciblage.

Identification des événements de recombinaison homologue dans les cellules souches embryonnaires de souris à l’aide de transfert de Southern et la réaction en chaîne par polymérase

Des endonucleases de restriction avec une nouvelle spécificité de séquence peuvent être développées à partir d’enzymes reconnaissant une séquence partiellement dégénérée. Ici, nous fournissons un protocole détaillé que nous avons utilisé avec succès pour modifier la spécificité de la séquence de l’enzyme NlaIV. Les ingrédients clés du protocole sont la compartimentation in vitro de la réaction de transcription/traduction et la sélection de variantes avec de nouvelles spécificités séquences.

In Vitro Directed Evolution of a Restriction Endonuclease with More Stringent Specificity

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Isolement des sous-populations de ribosomes subcellulaires basé sur la biotinylation enrichie par éclairage restreinte par peptide peptidique spécifique à la marque de recombinaison

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