Name: Un test de complémentation de la luciférase fractionnée pour la mesure temporellement résolue de la clairance des tau dans la microglie (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-07-24T14:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: Découvrez un test de complémentation de la luciférase fractionnée pour surveiller en temps réel la clairance des tau dans la microglie dérivée de cellules iPSC humaines. Cette méthode offre une résolution temporelle améliorée pour étudier les mécanismes cellulaires impliqués dans les maladies neurodégénératives.

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</ol>

<table><tbody><tr><td>Accutase</td><td>Thermo Scientific</td><td>A1110501</td><td></td></tr><tr><td>Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-268</td><td></td></tr><tr><td>Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-free, LDEV-free</td><td>Corning</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, HEPES</td><td>Thermo Scientific</td><td>11330057</td><td></td></tr><tr><td>Doxycycline</td><td>Clontech</td><td>631311</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>14-190-250</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Thermo Scientific</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Graphing Software</td><td>GraphPad Prism (ou similaire)</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Human GM-CSF</td><td>Thermo Scientific</td><td>300-03</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut DMEM</td><td>Thermo Scientific</td><td>10829018</td><td></td></tr><tr><td>Luminescent Plate Reader</td><td>SpectraMax i3x (ou similaire) - Molecular Devices</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge Tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-682-002</td><td></td></tr><tr><td>Microplate, 96 Well, PS, Half-area, White</td><td>Greiner</td><td>675075</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR Plus</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>100-0276</td><td></td></tr><tr><td>Nano-Glo HiBiT Lytic Detection System</td><td>Promega</td><td>N3030</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine hydrobromide&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN15017750</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human IL-34</td><td>Thermo Scientific</td><td>200-34</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human M-CSF</td><td>Thermo Scientific</td><td>300-25</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human TGF-&beta;1</td><td>Thermo Scientific</td><td>100-21C</td><td></td></tr><tr><td>Surface Treated Sterile Tissue Culture Plates</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB012927</td><td></td></tr><tr><td>Tau-HiBiT protein</td><td>In house</td><td>n/a</td><td>Protéine Tau avec une étiquette peptidique VSGWRLFKKIS</td></tr><tr><td>Trypsin Inhibitor</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9128</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Thermo Scientific</td><td>5-200-072</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 dihydrochloride</td><td>Bio-techne</td><td>1254</td><td></td></tr></tbody></table>

un test de complémentation de la luciférase fractionnée pour la mesure temporellement résolue de la clairance des tau dans la microglie

A Split-Luciferase Complementation Assay for Temporally Resolved Measurement of Tau Clearance in Microglia

Un test de complémentation de la luciférase fractionnée pour la mesure temporellement résolue de la clairance des tau dans la microglie

As the resident immune cells of the central nervous system, microglia are central regulators of brain homeostasis and key mediators of neurodegenerative ...

Notre recherche étudie les mécanismes cellulaires inconnus sous-jacents à la propagation et à l'élimination du tau dans le cerveau, un facteur majeur des maladies neurodégénératives. Ce protocole mesure l'élimination du tau dans divers systèmes cellulaires, en analysant spécifiquement l'élimination des fibrilles et des monomères de tau par les microglies.Pour commencer, utilisez une méthode de clonage standard, telle que l'assemblage Gibson, pour ajouter le peptide de luciférase scindée ou l'étiquette SLP sur un construit de protéine tau afin de créer un construit de tau marquée ou un construit Tau-SLP. Après expression et purification du Tau-SLP, vérifiez la pureté par électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de dodécylsulfate de sodium (SDS-PAGE). Ensuite, éliminez l'endotoxine bactérienne avant toute utilisation avec des cellules microgliales. Quantifiez la concentration du construit de tau marquée à l’aide d’un dosage BCA standard. Validez la luminescence fonctionnelle du construit Tau-SLP en établissant une courbe standard à l’aide d’un substrat de luciférase disponible commercialement et d’un réactif de complémentation, conformément aux instructions du fabricant. Différenciez une lignée de cellules souches pluripotentes induites, ou iPSC, portant six facteurs de transcription inductibles à la doxycycline, afin de produire des cellules microgliales de type microglie induite par facteurs de transcription (iTF-Microglie), selon un protocole validé. Entretenez les cellules en milieu approprié à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone. Semez 100 000 cellules par puits en utilisant 250 microlitres de milieu dans une plaque de 24 puits, en triple exemplaire par condition. Incubez la plaque toute une nuit à 37 degrés Celsius et 5 % d’oxygène. Retirez le milieu de culture. Lavez les cellules une fois avec 250 microlitres de PBS, puis remplacez par 250 microlitres de milieu de culture frais. Pour mesurer l’élimination du Tau-SLP, exposez temporellement les cellules au monomère ou au construit fibrillaire de Tau-SLP dans un milieu, de manière décalée, de sorte que tous les puits soient exposés pendant une heure et récoltés simultanément, tout en ne différant que par la durée d’élimination sur un laps de temps de 5 heures. Incluez des puits non traités avec le construit de tau marquée afin de soustraire le bruit de fond. Ajoutez un milieu contenant du Tau-SLP à 100 nanomolaire au groupe d’élimination de quatre heures à l’heure 0 du début du traitement. À la fin de la période d’internalisation d’une heure, lavez les cellules traitées trois fois au PBS pour éliminer le Tau-SLP extracellulaire. Ajoutez ensuite du milieu de culture sans Tau-SLP et incubez pendant la durée d’élimination prévue. Ensuite, à l’heure 2, ajoutez le milieu contenant le construit au groupe d’élimination de deux heures, puis remplacez-le par du milieu sans Tau-SLP à l’heure 3, comme indiqué précédemment. Enfin, à l’heure 4, ajoutez le milieu contenant le construit au groupe d’élimination de 0 heure et incubez pendant une heure avant la récolte simultanée. Après tous les temps d’élimination, retirez le milieu de chaque puits et lavez avec 250 microlitres de PBS. Traitez chaque puits avec 250 microlitres de trypsine-EDTA à 0,25 % pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius. Neutralisez chaque puits avec 250 microlitres d’inhibiteur de trypsine à 5 mg/mL. Récupérez le contenu de chaque puits dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre correctement étiqueté, puis faites précipiter les cellules par centrifugation à 500 g pendant cinq minutes. Préparez un volume suffisant de tampon de lyse contenant le substrat de luciférase et les composants de complémentation. Utilisez une pipette aspirante pour retirer le surnageant. Resuspendez le culot cellulaire dans 50 microlitres du tampon de lyse préparé afin de former le complexe de complémentation de la luciférase scindée, générant ainsi une émission lumineuse. Transférez immédiatement les cellules lysées dans une plaque 96 puits blanche à demi-volume. Lisez la luminescence sur un lecteur de microplaque après agitation orbitale pendant 10 secondes à température ambiante. Déterminez l’abondance normalisée du Tau-SLP en soustrayant la valeur moyenne de luminescence obtenue à partir des puits non traités. Normalisez chaque valeur par rapport au signal moyen corrigé du bruit de fond du groupe d’élimination de 0 heure. Tracez l’abondance normalisée du Tau-SLP en fonction du temps d’élimination, puis calculez le pourcentage d’élimination du Tau-SLP.Les conjugués monomériques de Tau-SLP ont été complètement éliminés dans les microglies ITF en 60 minutes, tandis que les conjugués fibrillaires de Tau-SLP persistaient au-delà de 240 minutes, indiquant la sensibilité du test basé sur la luminescence à détecter les différences dans le traitement des espèces de Tau-SLP par les microglies. Une évaluation supplémentaire, comparant l'élimination d'un conjugué monomérique de Tau-SLP à celle d'un conjugué mutant de Tau-SLP, a montré une cinétique d'élimination significativement réduite du Tau-SLP mutant uniquement lors des courtes périodes d'élimination de 15 minutes. Une validation croisée de l'élimination du Tau-SLP à l'aide du perturbateur lysosomal L-Leucyl-L-Leucine méthyl ester a révélé des concentrations à l'état stationnaire de Tau-SLP significativement augmentées au temps zéro d'élimination, ainsi qu'une vitesse de dégradation significativement réduite, caractérisée par une augmentation quatre fois plus élevée du Tau-SLP restant après une fenêtre d'élimination de 60 minutes. La comparaison de l'élimination du Tau-SLP entre les neurones dérivés de cellules souches pluripotentes induites (iPSC) et les microglies a révélé une cinétique d'élimination réduite pour les conjugués de Tau-SLP monomérique et fibrillaire dans les cellules neuronales.À l'aide de ce protocole, les chercheurs peuvent étudier les voies cellulaires régulant l'élimination de la protéine tau dans différents types cellulaires et diverses conditions. Une trypsination complète, nécessaire pour éliminer la tau extracellulaire, est essentielle ; une élimination incomplète ou une perte cellulaire fausse le signal d'élimination. De futures recherches pourraient étendre ce dosage à d'autres types cellulaires, notamment les astrocytes et les oligodendrocytes, ou marquer la tau endogène par CRISPR au niveau du locus MAPT.

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Cette vidéo montre le test de complémentation de la luciférase fractionnée pour détecter les interactions protéine-protéine. Dans cet essai, les protéines d’intérêt sont associées à de petits et de grands fragments de l’enzyme luciférase. Lorsque les protéines interagissent, les grands et les petits fragments se combinent pour former un complexe enzymatique actif, qui, en présence d’un substrat spécifique, libère une luminescence brillante qui peut être mesurée.

Essai de complémentation de la luciférase fractionnée pour identifier des interactions protéine-protéine spécifiques

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Technique de cytométrie en flux FRET pour détecter l’agrégation de protéines rapporteures induite par la graine de protéine tau

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Un test cellulaire pour évaluer l’absorption de la protéine tau par la microglie

Le transfert de cellule à cellule d’agrégats de protéines, ou de graines protéopathiques, peut être à l’origine de la progression de la pathologie dans les maladies neurodégénératives. Ici, un nouveau test de cytométrie en flux FRET est décrit qui permet une détection spécifique et sensible de l’activité d’ensemencement à partir d’échantillons recombinants ou biologiques.

Détection sensible de Proteopathic semis Activité FRET avec la cytométrie en flux

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Un modèle in vitro pour étudier l’agrégation de Tau à l’aide de la transduction à médiation Lentivirale des neurones humains

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Utilisation de l’imagerie de cellules vivantes pour mesurer les effets de protéines pathologiques sur le transport axonal dans les neurones primaires de l’hippocampe

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