ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nous remercions le Dr. Shital Suryavanshi et le personnel de l'élevage animalier du Tata Institute of Fundamental Research pour leur excellent soutien. Nous remercions le Dr. Sundar Naganathan de nous avoir aimablement autorisés à utiliser le microscope stéréo macro zoom Olympus MVX10 de son laboratoire pour enregistrer la vidéo de la procédure. Ce travail a été financé par une subvention du Department of Atomic Energy (DAE), Gouvernement de l'Inde, numéro d'identification du projet RTI4003 et RTI4015 (ST) ; subvention ICMR-DHR SUG, GAP00303, subvention ANRF PMECRG GAP00313 (AP).

Toutes les procédures sont approuvées et réalisées conformément au comité d'éthique institutionnel pour l'expérimentation animale du Tata Institute of Fundamental Research.
1. Préparation du matériel
<ol>
	<li>Préparer tous les instruments nécessaires à la microdissection (voir le tableau des matériaux) avant de commencer la procédure. Stériliser tous les instruments à l’aide d’éthanol à 70 %. Pour la collecte d’échantillons destinés à des applications ultérieures telles que la transcriptomique spatiale ou l’hybridation in situ, essuyer les instruments avec une solution de décontamination anti-RNase.</li>
	<li>Nettoyer le plateau du microscope de dissection avec une solution de décontamination anti-RNase et garder à portée de main, près du poste de dissection, une bouteille de PBS 1× glacé.</li>
	<li>Préparer les instruments et le matériel plastique suivants avant cette procédure :
	<ol>
		<li>Pour la préparation de l’animal, prévoir : 2 paires de pinces contondantes, 1 paire de ciseaux chirurgicaux, 2 boîtes de Pétri (10 cm) et plusieurs boîtes de Pétri (6 cm ; selon les besoins, une par tête).</li>
		<li>Pour l’isolement du cerveau, prévoir : 1 paire de pinces n°5, 1 paire de pinces n°55, 1 paire de ciseaux de microdissection, ainsi que des tubes ou boîtes de collecte adaptés à l’application ultérieure.</li>
		<li>REMARQUE : Si l’application ultérieure implique une hybridation in situ ou une transcriptomique spatiale, nettoyer les instruments de dissection avec une solution de décontamination anti-RNase avant utilisation.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Préparation des animaux
<ol>
	<li>Suivre les étapes (2.1.1–2.1.6) pour les animaux E14,5–P0
	<ol>
		<li>Endormir la femelle gestante conformément aux directives du comité d'éthique institutionnel pour l'utilisation des animaux. Dans l'exemple présenté, la femelle a été euthanasiée par dislocation cervicale.</li>
		<li>Réaliser une incision médiane dans la cavité abdominale de la femelle gestante afin d'exposer l'utérus. À l'aide de pinces effilées, extraire délicatement les cornes utérines et les placer dans une boîte de Pétri stérile de 10 cm contenant du PBS 1×&#160;refroidi sur glace.</li>
		<li>Isoler soigneusement chaque fœtus en le séparant du sac amniotique et du placenta environnants.&#160;</li>
		<li>Transférer les fœtus dans une nouvelle boîte de Pétri de 10 cm contenant du PBS 1× refroidi sur glace, et maintenir sur glace jusqu'à ce que chacun soit utilisé pour l'isolement du cerveau. Transférer un fœtus à la fois dans une boîte de Pétri de 6 cm contenant du PBS refroidi sur glace.&#160;</li>
		<li>Pour les stades postnataux jusqu'à P7, euthanasier le petit conformément aux directives du comité d'éthique institutionnel pour l'utilisation des animaux. Ensuite, poursuivre à partir de l'étape 2.1.6.</li>
		<li>À l'aide d'une paire de ciseaux chirurgicaux, séparer la tête du corps de manière à inclure le cerveau postérieur dans la tête afin de protéger le prosencéphale contre tout dommage involontaire.</li>
		<li>Laver la tête avec du PBS froid pour éliminer le sang. Transférer dans une boîte de Pétri propre de 6 cm contenant du PBS 1× refroidi sur glace. Garder la tête immergée dans le PBS afin de permettre l'élimination du sang et des débris au cours des étapes ultérieures de dissection.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Procédure de dissection pour isoler le cerveau en conservant la glande pinéale intacte
REMARQUE : Toutes les étapes ci-dessous doivent être effectuées à l’aide d’un microscope stéréoscopique. Régler le grossissement à au moins 2× (ou selon les besoins) afin de visualiser clairement le cerveau et les structures environnantes tout au long de la dissection. L’ensemble du processus de dissection doit être réalisé dans du PBS glacé afin de minimiser la dégradation de l’ARN et des protéines. Pour les étapes 3.1 à 3.10, utiliser la main non dominante pour maintenir fermement la tête et la stabiliser tout au long de la procédure, conformément aux instructions de l’étape 3.1. Les étapes 3.2 à 3.9 doivent être effectuées en stabilisant la tête avec la main non dominante, tandis que la main dominante exécute les gestes fins, en commençant par une pince n°5, puis en passant à la pince n°55 ou aux ciseaux de microdissection selon les indications de chaque étape.&#160;
<ol>
	<li>Utilisez une pince #5 dans la main non dominante. Insérez les deux pointes dans les orbites oculaires à l’aide d’un mouvement ferme vers le bas. Maintenez une pression vers le bas afin d’immobiliser le cerveau au fond de la boîte de Pétri jusqu’à la fin de l’étape 3.9.&#160; 
	REMARQUE : Le cerveau se situe au-dessus des orbites oculaires et n’est pas affecté par l’insertion de la pince dans celles-ci. Le maintien d’une pression constante vers le bas stabilise le cerveau tout au long de la dissection.&#160;</li>
	<li>À l’aide de la main dominante, pincez et retirez la peau recouvrant la tête avec une pince #5.&#160; 
	REMARQUE : À ce stade, le chondrocrâne lisse apparaît recouvrant le cerveau.</li>
	<li>Retirez la portion du chondrocrâne qui recouvre le mésencéphale et le métencéphale comme suit :
	<ol>
		<li>Utilisez la pince #5 pour effectuer deux incisions pénétrantes dans le chondrocrâne de chaque côté du mésencéphale, juste à l’endroit où il rejoint le télencéphale.</li>
		<li>Faites glisser une pointe de la pince #5 tangentiellement sous le chondrocrâne le long de la ligne tangentielle imaginaire séparant le télencéphale du mésencéphale. Saisissez fermement et déchirez le chondrocrâne.</li>
		<li>Continuez à retirer le chondrocrâne de manière à exposer le mésencéphale et le métencéphale.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Changez pour la pince #55. Insérez une pointe juste sous le bord postérieur du chondrocrâne recouvrant le télencéphale. Séparez délicatement le chondrocrâne en détachant tous les liens avec les tissus vasculaires et méningés.</li>
	<li>À l’aide d’une paire de ciseaux de microdissection, incisez le long de la ligne médiane dorsale du télencéphale en direction du bulbe olfactif. À l’aide de la pince #55 fermée, retirez délicatement tous les attachements restants du chondrocrâne au cerveau. Séparez les deux moitiés du chondrocrâne recouvrant les hémisphères télencéphaliques à l’aide de la pince #5. 
	REMARQUE : À ce stade, le SSS apparaît comme une veine rouge foncé le long de la marge supérieure du chondrocrâne dans le cerveau, et le TS est visible perpendiculairement au SSS.</li>
	<li>La glande pinéale se trouve juste sous le SSS. Effectuez une incision à l’extrémité rostrale du SSS à l’aide d’une paire de ciseaux de microdissection.&#160;</li>
	<li>À l’aide de la pince #55, retirez complètement la portion dorsale du chondrocrâne de chaque côté afin d’exposer davantage la glande pinéale, le SSS et le TS.</li>
	<li>Effectuez deux incisions dans le TS de chaque côté de la glande pinéale à l’aide d’une paire de ciseaux de microdissection. À l’aide de la pince #55, détachez les attaches latérales du TS.&#160;</li>
	<li>À l’aide de la pince #5 fermée, décollez délicatement la portion rostrale du cerveau de la voûte crânienne ventrale. Faites glisser la pince fermée sous la face ventrale du cerveau afin de le détacher complètement.&#160;</li>
	<li>Conservez le cerveau avec la glande pinéale intacte, selon les besoins pour les applications ultérieures.</li>
</ol>
4. Étapes critiques du protocole
REMARQUE : La réussite de ce protocole de dissection dépend d'une manipulation minutieuse des attaches vasculaires entourant la glande pinéale. Les points suivants sont essentiels pour maintenir la glande pinéale intacte tout au long de la procédure de dissection :
<ol>
	<li>Stabiliser la tête en insérant les branches d'une pince n°5 dans les deux orbites et maintenir une pression ferme vers le bas pendant toutes les étapes 3.1 à 3.9. Cela assure un soutien stable tout en évitant une pression directe sur le cerveau.</li>
	<li>Lors du retrait du chondrocrâne (étape 3.3), éviter toute traction ou décollement excessive, car cela pourrait entraîner un détachement de la glande pinéale du diencéphale dorsal.</li>
	<li>Lors de l'élimination des attaches méningées et vasculaires (étape 3.4) et de l'ouverture du chondrocrâne télocéphalique dorsal (étape 3.5), utiliser uniquement les pointes de la pince n°55. Une pénétration profonde de la pince pourrait endommager la glande pinéale, située immédiatement sous le toit télocéphalique caudal.</li>
	<li>Effectuer complètement la section du sinus sagittal supérieur (étape 3.6) et la section bilatérale du sinus transverse (étape 3.8) avant d'extraire le cerveau. Ces incisions relâchent la tension au sein du réseau veineux dorsal et empêchent le cisaillement de la glande pinéale lors du retrait du cerveau.</li>
	<li>À l'étape 3.9, déloger délicatement le cerveau à l'aide d'une pince fermée sans perturber la ligne médiane dorsale. Le cerveau doit se détacher librement de la voûte crânienne une fois toutes les attaches méningées et vasculaires relâchées.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Nakahara D, Nakamura M, Iigo M, Okamura H. Bimodal circadian secretion of melatonin from the pineal gland in a living CBA mouse. Proc Natl Acad Sci U S A. 2003;100(16):9584-9.</li>
	<li>Christ E, Pfeffer M, Korf HW, von Gall C. Pineal melatonin synthesis is altered in Period1-deficient mice. Neuroscience. 2010;171(2):398-406.</li>
	<li>Rath MF. Homeobox gene-encoded transcription factors in development and mature circadian function of the rodent pineal gland. J Pineal Res. 2024;76(3):e12950.</li>
	<li>Rath MF, Rohde K, Klein DC, M&#248;ller M. Homeobox genes in the rodent pineal gland: roles in development and phenotype maintenance. Neurochem Res. 2013;38(6):1100-12.</li>
	<li>Estivill-Torr&#250;s G, Vitalis T, Fern&#225;ndez-Llebrez P, Price DJ. The transcription factor Pax6 is required for development of the diencephalic dorsal midline secretory radial glia that form the subcommissural organ. Eur J Neurosci. 2001;14(6):1011-22.</li>
	<li>Dias M, et al. Transection of the superior sagittal sinus enables bilateral access to the rodent midline brain structures. eNeuro. 2021;8(4):ENEURO.0146-21.2021.</li>
	<li>Matsunaga MM, et al. Morphologic analysis of mice&#39;s pineal gland. J Morphol Sci. 2011;28(3):157-60.</li>
	<li>Boeckmann D. Morphological investigation of the deep pineal of the rat. Cell Tissue Res. 1980;210(2):283-94.</li>
	<li>Parichha A, et al. Constitutive activation of canonical Wnt signaling disrupts choroid plexus epithelial fate. Nat Commun. 2022;13:633.</li>
	<li>Parichha A, et al. Dentate gyrus morphogenesis is regulated by &#946;-catenin function in hem-derived fimbrial glia. Development. 2022;149(21):dev200953.</li>
	<li>Sparks DL, Coyne CM, Sparks LM, Hunsaker JC 3rd. Recommended technique for brain removal to retain anatomic integrity of the pineal gland in order to determine its size in sudden infant death syndrome. J Forensic Sci. 1997;42(1):100-2.</li>
	<li>Bowyer JF, et al. A visual description of the dissection of the cerebral surface vasculature and associated meninges and the choroid plexus from rat brain. J Vis Exp. 2012;69:e4285.</li>
	<li>Calvo J, Boya J. Embryonic development of the rat pineal gland. Anat Rec. 1981;200(4):491-500.</li>
</ol>

Tous les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt concurrent.

Des méthodes normalisées de dissection de la glande pinéale ont été mises au point pour le cerveau fœtal et infantile humain, aidant ainsi les médecins légistes à comprendre les causes du syndrome de mort subite du nourrisson11. Des protocoles antérieurs ont démontré l'ablation de la glande pinéale accompagnée des vaisseaux sanguins superficiels, des méninges et du plexus choroïde12 ; toutefois, aucune méthode permettant de conserver de façon fiable une glande pinéale intacte attachée au toit du diencéphale durant les stades précoces de son développement chez la souris ou d'autres rongeurs n'a encore été décrite.
Une grande partie de la littérature anatomique et méthodologique classique décrivant la pinéalectomie et son analyse a été établie à l'aide de modèles de rat13, chez lequel la glande est plus volumineuse et plus facile à identifier. En revanche, la glande pinéale de la souris est nettement plus petite et plus fragile, ce qui la rend particulièrement sujette à la perte ou aux dommages durant les procédures habituelles d'extraction du cerveau. Certaines études ont tenté de surmonter cette difficulté en fixant le cerveau dans l'ensemble du crâne. Toutefois, cela introduit des limitations techniques supplémentaires lors de la préparation du tissu pour la coupe histologique. Par exemple, lors de la cryoprotection dans une solution de saccharose à 30 % après fixation dans du paraformaldéhyde à 4 %, la voûte crânienne peut exercer une pression sur le tissu cérébral sous-jacent, provoquant une compression ou une déformation des structures du prosencéphale dorsal. De tels artefacts peuvent compromettre la morphologie cérébrale et compliquer les analyses fondées sur une organisation anatomique précise. De plus, la fixation du tissu peut ne pas convenir à toutes les applications. Par conséquent, des méthodes permettant de préserver la glande pinéale tout en maintenant son attachement au toit du diencéphale, sans nuire à l'intégrité globale du cerveau, sont nécessaires afin de faciliter les études développementales et moléculaires de la glande pinéale chez la souris.
La préservation fiable de la glande pinéale dans des préparations cérébrales intactes est importante pour plusieurs applications expérimentales. Les approches histologiques et moléculaires, telles que l'immunohistochimie et l'hybridation in situ, nécessitent la préservation de l'architecture tissulaire afin d'analyser l'expression génique et l'organisation cellulaire au sein de la glande. Plus récemment, des technologies émergentes telles que la transcriptomique spatiale et d'autres méthodes de profilage moléculaire à résolution spatiale dépendent également de la morphologie tissulaire intacte pour cartographier l'expression génique dans des contextes anatomiques spécifiques. À ce jour, aucune carte transcriptomique spatiale de la glande pinéale embryonnaire de la souris n'a été publiée. Cela pourrait en partie refléter la difficulté technique liée à la préservation de la glande pinéale intacte lors de la dissection cérébrale conventionnelle. Par conséquent, des méthodes permettant de maintenir de façon fiable l'intégrité de la glande pinéale devraient faciliter l'application de nouvelles approches transcriptomiques spatiales en biologie de la glande pinéale. De plus, comme la glande pinéale représente une fraction très faible du tissu cérébral total, l'isolement du cerveau avec la glande pinéale intacte permet une étape complémentaire consistant à prélever spécifiquement la glande pinéale, et la mise en commun de ces prélèvements améliorerait considérablement l'enrichissement de la représentation spécifique à la glande pinéale dans les analyses globales de transcriptomique et de protéomique.
Il est nécessaire de bien stabiliser la tête à l'aide d'une pince n°5 tenue dans la main non dominante. Cette stabilisation doit être maintenue tout au long du processus de dissection ; par conséquent, la main dominante doit gérer le changement d'instruments selon les besoins. Ajustez l'illumination afin de mieux visualiser les attaches de la pinéale aux tissus vasculo-méningés sus-jacents, qui doivent être retirés.

La glande pinéale est une petite structure neuroendocrine située à la ligne médiane dorsale du cerveau des vertébrés et joue un rôle central dans la régulation de la physiologie circadienne par la sécrétion rythmique de mélatonine1,2. Au cours de l'embryogenèse des mammifères, la glande pinéale se développe à partir de la ligne médiane dorsale du prosencéphale en formation. Chez la souris, le développement pinéal commence lorsque une région spécialisée de l'épithélium neuroépithélial dorsal du diencéphale forme l'anlage pinéal ou le sillon pinéal, qui s'évagine ensuite pour former le diverticule pinéal au jour embryonnaire (E) 14,53,4,5. Ce diverticule est attaché au toit du diencéphale et se situe entre les vésicules télocéphaliques appariées. Au fur et à mesure du développement, ce diverticule s'associe étroitement aux structures sus-jacentes situées à la ligne médiane dorsale du cerveau, en particulier au sinus sagittal supérieur (SSS) et au sinus transverse (TS), des voies veineuses qui courent le long de la surface dorsale du prosencéphale6. La glande pinéale en développement se trouve juste en dessous de l'intersection du SSS et du TS, et son attache délicate au diencéphale dorsal est particulièrement vulnérable lorsque les structures vasculo-méningées sus-jacentes sont retirées pour extraire le cerveau de la voûte crânienne7. Cela rend la glande pinéale particulièrement sujette aux lésions, car elle peut être arrachée lors de l'ouverture de la voûte crânienne pour l'extraction du cerveau. En conséquence, la glande pinéale est fréquemment perdue lors de dissections courantes, ce qui limite l'analyse de sa structure et de sa composition moléculaire dans des préparations intactes.
Ici, nous décrivons un protocole étape par étape pour disséquer le cerveau de la souris tout en préservant la glande pinéale et son insertion sur le toit du diencéphale. La méthode s'applique aux stades embryonnaires à partir de E16,5 jusqu'aux premiers stades postnataux (P7), et convient aux études du développement de la glande pinéale utilisant l'hybridation in situ, l'immunohistochimie et la transcriptomique spatiale. À titre de démonstration d'applications ultérieures, l'hybridation in situ et l'immunohistochimie du marqueur enrichi dans la glande pinéale, CRX, sont présentées.
L'innovation principale de cette méthode réside dans le fait que les contraintes exercées sur les structures médianes sont minimisées en supprimant soigneusement les attaches physiques qui, autrement, arracheraient la glande pinéale lors du retrait du cerveau de la cavité crânienne. Cette approche constitue une amélioration par rapport à la procédure standard.
Cette méthode de dissection est limitée aux stades allant jusqu'à P7, car l'ossification progressive de la voûte crânienne au cours du développement postnatal précoce augmente la rigidité du crâne et renforce son association avec les structures méningées et vasculaires. Bien que plusieurs études aient décrit des protocoles de dissection de la glande pinéale chez les rongeurs adultes8, très peu se sont concentrées sur la préservation de la glande pinéale au stade embryonnaire et au cours des premiers stades postnataux, époque à laquelle la glande est particulièrement fragile et sensible aux dommages pendant l'isolement du cerveau.

<table><tbody><tr><td>Microscope en champ clair</td><td>Olympus</td><td>IX73</td><td>Tout microscope en champ clair équipé d'une caméra couleur convient.</td></tr><tr><td>Microscope confocal</td><td>Olympus</td><td>FV3000</td><td>Tout microscope confocal ou microscope à épifluorescence convient, selon la résolution requise</td></tr><tr><td>Anticorps anti-CRX</td><td>Invitrogen</td><td>PA5-32182</td><td>Protocole d'immunomarquage décrit dans Parichha et al.&lt;sup&gt;9&lt;/sup&gt;.</td></tr><tr><td>Sonde CRX</td><td>Personnalisée</td><td>Personnalisée</td><td>Protocole d'hybridation in situ de Parichha et al.&lt;sup&gt;10&lt;/sup&gt;.</td></tr><tr><td>Pinces fines&amp;nbsp;# 5</td><td>F.S.T</td><td>11251-23</td><td>Peuvent être remplacées par des outils similaires provenant de n'importe quelle entreprise.</td></tr><tr><td>Pinces fines&amp;nbsp;# 55</td><td>F.S.T</td><td>11255-20</td><td>Peuvent être remplacées par des outils similaires provenant de n'importe quelle entreprise.</td></tr><tr><td>PBS, pH 7,4</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td>Peut être remplacé par des produits similaires provenant de n'importe quelle entreprise.</td></tr><tr><td>Boîte de Pétri</td><td>Corning</td><td>CLS351029</td><td>Peut être remplacée par des produits similaires provenant de n'importe quelle entreprise.</td></tr><tr><td>RNaseZap</td><td>Invitrogen</td><td>AM9782</td><td>La solution de décontamination RNaseZap est une solution de décontamination de surface qui détruit les RNases au contact&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Ciseaux à ressort (ciseaux de microdissection)</td><td>F.S.T</td><td>15020-15</td><td>Peuvent être remplacés par des outils similaires provenant de n'importe quelle entreprise.</td></tr><tr><td>Microscope stéréo-zoom</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td>Tout microscope de dissection convient</td></tr></tbody></table>

préservation de la glande pinéale dans les préparations de cerveau de souris périnatales

Preserving the Pineal Gland in Perinatal Mouse Brain Preparations

La glande pinéale, une structure neuroendocrine qui sécrète la mélatonine, se forme à partir d'une anlase située à la ligne médiane dorsale du prosencéphale embryonnaire. Chez la souris, au jour embryonnaire (E) 14,5, un diverticule pinéal apparaît en saillie à partir du toit du diencéphale, entre les vésicules télocéphaliques appariées. Ce diverticule est en contact étroit avec les tissus cartilagineux, méningés et vasculaires sus-jacents. Il est facilement perdu lors de l'ouverture de la voûte crânienne pour l'extraction du cerveau aux stades embryonnaires tardifs ou postnataux précoces. Malgré son rôle neuroendocrinien important, le développement précoce de la glande pinéale et les mécanismes de signalisation qui régulent ce processus restent mal compris, en partie en raison de la difficulté à préserver cette structure intacte durant les stades embryonnaires du développement cérébral de la souris.
Cet article présente une procédure de dissection innovante qui préserve la glande pinéale tout en maintenant son intégrité structurelle et son attachement au toit du diencéphale lors de l'isolement du cerveau, des stades embryonnaires jusqu'au jour postnatal (P) 7. La procédure est démontrée à l'aide d'un cerveau de souris E18,5 et convient donc aux applications en aval nécessitant la préservation de l'architecture tissulaire, notamment l'hybridation in situ, l'immunohistochimie et la transcriptomique spatiale. Le protocole peut également être utilisé pour isoler la glande pinéale en développement, améliorant ainsi la représentation spécifique de la pinéale dans les analyses transcriptomiques et protéomiques, ce qui est autrement difficile en raison de sa petite taille.

Ce protocole de dissection permet l'isolement reproductible de cerveaux de souris embryonnaires et postnataux précoces, de E16,5 à P7, avec la glande pinéale conservée dans sa position anatomique d'origine (Figure 1).
Le retrait progressif du chondrocrâne, combiné à un évidement soigneux des attaches méningées et vasculaires, évite les contraintes de cisaillement involontaires sur la glande pinéale. En outre, la section contrôlée du sinus sagittal supérieur (SSS) à son extrémité rostrale, ainsi que les incisions bilatérales du sinus transverse (TS), libèrent efficacement la tension exercée sur le réseau vasculaire dorsal. Cela protège la glande pinéale contre un arrachement lors de l'extraction ultérieure du cerveau. En conséquence, la glande pinéale reste intacte et attachée à la ligne médiane du diencéphale après l'isolement du cerveau par rapport à la voûte crânienne (Figure 2A).
Afin de tester l'intégrité de la glande pinéale préservée et son aptitude à des applications ultérieures, une hybridation in situ du marqueur de la glande pinéale Crx, ainsi qu'une immunohistochimie de la protéine CRX ont été réalisées9,10 (Figure 2B–D). Ces analyses ont confirmé l'identité et l'intégrité structurelle de la glande pinéale.
Le protocole de dissection a été validé à plusieurs stades de développement, et la glande pinéale a été conservée intacte dans la grande majorité des essais : E16,5 (N = 10), E18,5 (N = 15), P0 (N = 10) et P7 (N = 6). Cela démontre que la méthode est robuste et hautement reproductible pour la conservation de la glande pinéale lors de l'isolement du cerveau embryonnaire et postnatal précoce (Figure 2E).
<img alt="Schéma de la technique de microdissection : processus de retrait du chondrocrâne à l'aide de forceps et de ciseaux." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71934/71934fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1789444946000" data-alt="Figure 1"> 
Figure 1: Images fixes extraites de la vidéo montrant la procédure pas à pas d'isolement du cerveau d'un embryon de souris E18.5, en conservant la glande pinéale intacte. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71934/71934fig1largev2.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Anatomie du cerveau de souris E18.5 ; attachement de la glande pinéale, schéma de coupe coronale, expression de Crx, DAPI/CRX." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71934/71934fig2.jpg" data-altupdatedat="1789444946000" data-alt="Figure 2"> 
Figure 2 : Résultats représentatifs. (A) Exemples représentatifs de deux cerveaux de souris E18.5 dont la glande pinéale est détachée lors de la procédure standard de dissection (à gauche), comparés à un cerveau dont la glande pinéale reste intacte grâce à la méthode décrite (à droite). (B) Illustration schématique d'une coupe coronale E18.5 montrant la glande pinéale en rose. (C) Hybridation in situ de Crx aux stades E16.5 et E18.5, démontrant une expression spécifique à la glande pinéale. (D) Immunomarquage de CRX à E18.5. (E) Histogramme montrant les taux de réussite (cerveau isolé avec glande pinéale intacte) et d'échec (glande pinéale endommagée ou perdue) du protocole aux stades développementaux embryonnaires (E16.5 et E18.5) et postnataux (P0 et P7). Échelles : 100 µm. N = 6 réplicats biologiques pour A, C et D. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71934/71934fig2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.</a>

Nous présentons ici un protocole de dissection permettant de préserver la glande pinéale, souvent perdue lors du retrait du cerveau de la cavité crânienne. Ce protocole garantit la conservation de la glande pinéale dans les préparations de cerveau de souris embryonnaires et postnatales précoces pour des applications ultérieures, notamment l'immunohistochimie, l'hybridation in situ et la transcriptomique spatiale.

Préservation de la glande pinéale dans les préparations de cerveau de souris périnatales

La glande pinéale, une structure neuroendocrine qui sécrète la mélatonine, se forme à partir d'un ébauche située sur la ligne médiane dorsale du prosencéphale embryonnaire. Au stade embryonnaire...

preserving-the-pineal-gland-in-perinatal-mouse-brain-preparations

Research

Recherche

JoVE Journal

Neuroscience

Neurosciences

Progénitrices neurales mitose est un paramètre critique de la neurogenèse. Une grande partie de notre compréhension des neurones progéniteurs mitose est basé sur l'analyse des tissus fixés. Imagerie en temps réel dans des tranches de cerveau embryonnaire est une technique souple pour évaluer la mitose avec une résolution temporelle et spatiale dans un environnement contrôlé.

Imagerie en direct de la mitose dans les développement Cortex souris embryonnaires

L'ampoule accessoire olfactif de la souris (AOB) a été difficile à étudier dans le contexte du codage sensoriel. Ici, nous démontrons une dissection qui produit in vivo préparation ex dans laquelle les neurones AOB restent fonctionnellement connectées à leurs entrées périphériques, ce qui facilite la recherche en traitement de l'information des phéromones de souris et kairomones.

Ex Vivo préparatifs de l&#39;ampoule Vomeronasal organes et accessoire olfactive Intact

Ici, nous démontrons une technique de transduction neuronale généralisée par injection intraventriculaire d’un virus adéno-associé dans le cerveau de souris néonatale.  Cette méthode offre un moyen rapide et facile d’obtenir l’expression à vie des transgènes délivrés par le virus.

Injection virale intracérébro du cerveau de souris nouveau-né pour la transduction neuronale persistante et généralisée

Capitalisant sur une stratégie génétique binaire, nous fournissons un protocole détaillé pour le traçage des circuits neuronaux chez les souris qui expriment des traceurs transsynaptiques complémentaires après recombinaison médiée par Cre. Parce que la production de traceurs spécifiques aux cellules est codée génétiquement, notre approche expérimentale convient pour étudier la formation et la maturation des circuits neuronaux au cours du développement du cerveau embryonnaire murin à une...

Transsynaptique génétique conditionnelle traçage dans le cerveau embryonnaire de souris

Nous décrivons un protocole permettant la purification du compartiment vasculaire du cerveau de la souris. Les vaisseaux cérébraux isolés comprennent des cellules endothéliales reliées par des jonctions serrées et entourées d’une lame basale continue, des péricytes, des cellules musculaires lisses vasculaires, ainsi que des membranes astrogliales périvasculaires.

Purification de souris vaisseaux cérébraux

Les projections supraspinales sont importantes pour la perception de la douleur et d’autres comportements, et les fibres sérotoninergiques sont l’un de ces systèmes de fibres. La présente étude s’est concentrée sur l’application du protocole combiné CLARITY/CUBIC à la moelle épinière de souris afin d’étudier la terminaison de ces fibres sérotoninergiques.

Imagerie fibres sérotoninergiques dans la moelle épinière de souris Utilisation du CLARITY / Technique CUBIC

Ce protocole décrit la stabilisation du niveau d’oxygène dans un petit volume de tampon recyclé et aspects méthodologiques de la plasticité synaptique activité dépendante d’enregistrement dans des tranches d’hippocampe aiguës immergés.

Enregistrement de la plasticité synaptique dans des tranches d’hippocampe aiguës maintenues dans un petit volume recyclage - Perfusion- et système de chambre de Submersion-type

Dans cet article, nous discutons trois préparations de cerveau utilisées pour l’enregistrement de germes entiers patch clamp pour étudier le circuit rétino des têtards de Xenopus laevis . Chaque préparation, avec ses propres avantages spécifiques, contribue à la traçabilité expérimentale du têtard de Xenopus comme modèle pour étudier la fonction des circuits neuronaux.

Préparations et protocoles pour toute cellule Patch Clamp enregistrement des neurones Tectal Xenopus laevis

Ici, nous décrivons une procédure pour la compensation des tissus, marquage fluorescent et l’imagerie à grande échelle du tissu de cerveau de souris qui, ainsi, permet la visualisation de l’organisation en trois dimensions des types de cellules dans le néocortex.

Imagerie tridimensionnelle à grande échelle de l’organisation cellulaire dans le néocortex de souris

Le locus coeruleus est un petit amas de neurones impliqués dans divers processus physiologiques. Nous décrivons ici un protocole visant à préparer les sections de cerveau de souris pour l’étude des protéines et des métaux dans ce noyau.

Localisation du Locus Coeruleus dans le cerveau de souris

Tata Institute of Fundamental Research.  Here we present a dissection protocol that preserves the pineal gland, which is often lost when the brain is removed from the cranial vault. This protocol ensures retention of the pineal gland in embryonic and early postnatal mouse brain preparations for downstream applications, including immunohistochemistry, in situ hybridization, and spatial transcriptomics.

Préservation de la glande pinéale dans les préparations de cerveau de souris périnatales

Explorer plus de vidéos